Mitochondrial Genome DNA Extraction Kit (for Animals)

1. Компоненты набора реагентов

2. Хранилище

This kit can be stored at room temperature (15-25℃) in dry conditions for 12 месяцы. The DNA extraction purification columns can be stored in a cool and dry environment for 1 год. протеиназа К и РНКаза А содержат консерванты, возможность транспортировки при комнатной температуре, но для длительного хранения, их следует хранить при -20 ℃. Reagent buffers E1/E2 should be stored at 4℃.

3. Инструкции по использованию набора реагентов

3.1 Этот набор реагентов предназначен для исследований в области молекулярной биологии и не должен использоваться для диагностики или лечения заболеваний..

3.2 Некоторые компоненты набора реагентов содержат раздражители.. Рекомендуются защитные меры, такие как ношение защитной одежды и очков..

3.3 Во время использования этого набора реагентов, высокоскоростная центрифуга, водяная баня (металлическая ванна), вихревой смеситель, безводный этанол, ПБС,стерильная деионизированная вода, и EP-трубки должны быть подготовлены пользователем..

4. Знакомство с набором реагентов

The Mitochondrial Genome Очистка ДНК Kit offers a rapid and efficient method for purifying DNA from animal tissues and cell cultures. Widely used in both animal tissue and cell cultures, this kit consists of two parts. The first part involves rapid collection of high-purity animal tissue and cell mitochondria using gradient centrifugation. The second part utilizes a column-based method for quick extraction of mitochondrial DNA without the need for toxic reagents like phenol-chloroform. Выделенная ДНК может быть непосредственно использована для ПЦР, Саузерн-блоттинг, и другие приложения.

5. Экспериментальные принципы и процедуры

6. Процесс экстракции

Прежде чем начать эксперимент:

А. Reagent Buffers B and C tend to precipitate under low-temperature conditions. It is recommended to heat them at 65°C for 5 minutes until the precipitates dissolve before normal use.

Б. Before using Промывной буфер 1, follow the instructions on the reagent bottle label to add the specified amount of absolute ethanol. Затем, check the label to indicate that ethanol has been added.

С. Элюирующий буфер представляет собой 0.1х ТЕ решение с минимальным содержанием ЭДТА. Если ЭДТА повлияет на последующие эксперименты, it is suggested to use sterile deionized water instead of the elution buffer.

Д. Mitochondrial Collection: The first part involves collecting mitochondria, where centrifugation is crucial. During the extraction process, centrifugal force is expressed in ‘g’. Most centrifuges have a rpm/g conversion mode, so please pay attention.

1. Образец обработки:

А. Take cell culture medium, centrifuge at 1000g for 1 Минута, чтобы собрать ячейки. Try to remove as much supernatant as possible. Добавлять 1ml PBS (PH7.9) to wash the cells, centrifuge to collect them, затем добавьте 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 to fully suspend the cells and homogenize rapidly 5-10 раз.

Б. Cut tissues not exceeding 200 mg into small pieces, добавлять 1ml PBS (PH7.9) for washing and absorb excess liquid with filter paper. Добавлять 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 and grind in an ice bath about 20 раз.

2. Transfer the liquid mixture to a centrifuge tube, центрифуга в 4℃, 1000G для 5 минуты, and transfer the supernatant to a new centrifuge tube.

(Примечание: There may be precipitates in this transferred supernatant. For obtaining high-purity mitochondria, it is recommended to centrifuge and transfer the supernatant during step 2.)

3. Transfer the supernatant obtained in the previous step to a new centrifuge tube, centrifuge at 12000g, 4℃ для 10 минуты, and discard the supernatant.

(Примечание: After this step, mitochondria will precipitate at the bottom of the tube.)

4. Recommended step: Добавлять 5ml Reagent Buffer E2 to the mitochondrial pellet, resuspend it, центрифуга в 4℃, 1000G для 5 минуты, перенесите супернатант в новую центрифужную пробирку, then centrifuge at 12000g, 4℃ для 10 минуты, выбросить супернатант, and obtain high-purity mitochondrial precipitates at the tube bottom.

(Примечание: Mitochondria collection at this step is complete. You may interrupt the experiment and store mitochondria at -70℃.)

Second Part: Isolation and Purification of Mitochondrial DNA

5. Добавлять 280мкл реагентного буфера B, 10мкл РНКазы А, and 10μl of Proteinase K to the centrifuge tube containing mitochondria. Thoroughly invert to mix, digest at 65℃ для 5 минуты.
6. Добавлять 300мкл реагентного буфера C к лизату и хорошо перемешайте. Если появился белый осадок, это может быть оставлено нетронутым; its disappearance will not affect subsequent experiments.
7. Добавлять 300мкл абсолютного этанола и тщательно перемешать. It may cause precipitation, но это не повлияет на последующие эксперименты.
8. Transfer the obtained liquid to the DNA extraction purification column (набор) (примерно 650~700 мкл каждый раз). Centrifuge at more than 8,000 об/мин для 1 минута, выбросить собранные отходы, и повторно вставьте пробирку для сбора в колонку очистки для следующего шага..
9. Поместите колонку для очистки экстракции ДНК (набор) в коллекционную трубку, добавлять 300мкл промывочного буфера 1, центрифуга при более чем 8,000 об/мин для 1 минута, выбросить отходы, и переосмыслить колонку очищения ДНК-экстракции (набор) в трубку для следующего шага.

(Примечание: Убедитесь, что в промывочный буфер добавлен абсолютный этанол. 1.)

10. Добавлять 400мкл промывочного буфера 1 в колонку очистки экстракции ДНК (набор), центрифуга в 14,000 об/мин (20,000×г) для 2 минуты. Extend centrifugation time appropriately for a drier membrane.
11. Поместите колонку для очистки экстракции ДНК (набор) в новой центрифужной трубе, open the cap, and incubate at 65℃ для 2 минуты. Extend this step as needed to evaporate ethanol completely to prevent residual ethanol from affecting downstream experiments.
12. Drip-suspend 50-100мкл элюирующего буфера на мембрану, центрифуга в 12,000 об/мин для 2 минуты.

(Примечание: 1. Eluting DNA with 50μl of Elution Buffer can increase DNA concentration but reduce the total yield; 2. The eluted DNA wash can be reapplied to the DNA extraction purification column for an additional collection at 12,000 об/мин для 2 minutes to increase DNA yield.)