미토콘드리아 게놈 DNA 추출 키트 (동물을 위한)

1. 시약 키트의 구성 요소

명세서	50티	100티
고양이. 아니요.	SN0237	SN0238
DNA 추출 컬럼 (세트)	50 (세트)	100 (세트)
시약 버퍼 E1	50밀리리터	2x50ml
시약 버퍼 E2	30밀리리터	2x30ml
시약 완충액 B	20밀리리터	2x20ml
시약 완충액 C	30 밀리리터	30 밀리리터
세척 버퍼 1	15 밀리리터	2 × 15 밀리리터
용출 버퍼	20 밀리리터	20 밀리리터
단백질분해효소 K	1밀리리터	1밀리리터
RNase A	1밀리리터	1밀리리터
사용 설명서	1	1

2. 저장

이 키트는 실온에서 저장할 수 있습니다 (15-25℃) 건조한 조건에서 12 개월. DNA 추출 정제 컬럼은 시원하고 건조한 환경에 저장 될 수 있습니다. 1 년도. 단백질분해효소 K 및 RNase A 방부제 함유, 실온에서 운송 가능, 하지만 장기간 보관을 위해서는, -20℃에 보관해야 합니다. 시약 버퍼 E1/E2는 4 ℃에 저장해야합니다.

3. 시약 키트 사용 지침

3.1 이 시약 키트는 분자생물학 연구용이므로 질병 진단이나 치료에 사용해서는 안 됩니다..

3.2 시약 키트의 일부 구성품에는 자극제가 포함되어 있습니다.. 보호복, 고글 착용 등의 보호 조치가 권장됩니다..

3.3 이 시약 키트를 사용하는 동안, 고속 원심분리기, 욕조 (금속 욕조), 소용돌이 믹서, 무수에탄올, PBS,멸균 탈이온수, EP 튜브는 사용자가 준비해야 합니다..

4. 시약 키트 소개

미토콘드리아 게놈 DNA 정제 키트는 동물 조직 및 세포 배양에서 DNA를 정제하는 빠르고 효율적인 방법을 제공합니다.. 동물 조직 및 세포 배양에 널리 사용됩니다, 이 키트는 두 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분은 구배 원심 분리를 사용하여 고순도 동물 조직 및 세포 미토콘드리아의 빠른 수집을 포함합니다.. 두 번째 부분은 페놀 클로로포름과 같은 독성 시약의 필요없이 미토콘드리아 DNA의 빠른 추출을 위해 컬럼 기반 방법을 활용합니다.. 추출된 DNA는 다음과 같은 목적으로 직접 사용될 수 있습니다. PCR, 서던 블로팅, 및 기타 응용 프로그램.

5. 실험 원리 및 절차

6. 추출과정

실험을 시작하기 전에:

ㅏ. 시약 버퍼 B 및 c 저온 조건에서 침전하는 경향이 있습니다. 65 ° C에서 가열하는 것이 좋습니다 5 정상적인 사용 전에 침전물이 용해 될 때까지 분.

비. 사용하기 전에 세척 버퍼 1, 시약 병 라벨의 지침에 따라 지정된 양의 절대 에탄올을 추가하십시오.. 그 다음에, 에탄올이 첨가되었음을 나타내는 라벨을 확인하십시오..

씨. 용출 완충액은 0.1x TE 솔루션 최소한의 EDTA 함량으로. EDTA가 후속 실험에 영향을 미치는 경우, 용리 완충액 대신 멸균 탈 이온수를 사용하는 것이 좋습니다..

디. 미토콘드리아 수집: 첫 번째 부분은 미토콘드리아 수집과 관련이 있습니다, 원심 분리가 중요한 곳. 추출 과정에서, 원심력은‘G’로 표현됩니다.. 대부분의 원심 분리기에는 RPM/G 변환 모드가 있습니다, 그러니주의를 기울이십시오.

1. 샘플 처리:

ㅏ. 세포 배양 배지를 복용하십시오, 1000g에서 원심 분리 1 세포를 수집하는 데 분. 가능한 한 많은 상청액을 제거하십시오. 추가하다 1ML PBS (ph7.9) 세포를 세척합니다, 그것들을 수집하기 위해 원심 분리, 그런 다음 추가 1ML 사전 냉각 (0℃) 시약 버퍼 E1 세포를 완전히 중단하고 균질화합니다 5-10 타임스.

비. 절단 조직은 초과하지 않습니다 200 작은 조각으로 MG, 추가하다 1ML PBS (ph7.9) 여과지로 과도한 액체를 세척하고 흡수하기 위해. 추가하다 1ML 사전 냉각 (0℃) 시약 버퍼 E1 그리고 얼음 목욕에 갈기 20 타임스.

2. 액체 혼합물을 원심 분리 튜브로 옮깁니다, 원심분리기 4℃, 1000g에 대한 5 분, 상청액을 새로운 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

(메모: 이 전달 된 상청액에는 침전물이있을 수 있습니다. 고순도 미토콘드리아를 얻기 위해, 단계 동안 상청액을 원심 분리하고 옮기는 것이 좋습니다. 2.)

3. 이전 단계에서 얻은 상청액을 새로운 원심 분리기로 옮깁니다., 12000G에서 원심 분리기, 4℃ ~을 위한 10 분, 그리고 상층액은 버린다.

(메모: 이 단계 후, 미토콘드리아는 튜브 바닥에서 침전 될 것입니다.)

4. 권장 단계: 추가하다 5ML 시약 완충제 E2 미토콘드리아 펠렛에, 그것을 재현합니다, 원심분리기 4℃, 1000g에 대한 5 분, 상등액을 새로운 원심분리 튜브로 옮긴다, 그런 다음 12000g에서 원심 분리하십시오, 4℃ ~을 위한 10 분, 상층액을 버린다, 튜브 바닥에서 고순도 미토콘드리아 침전물을 얻습니다.

(메모: 이 단계에서 미토콘드리아 수집이 완료되었습니다. 실험을 중단하고 미토콘드리아를 보관할 수 있습니다 -70℃.)

두 번째 부분: 미토콘드리아 DNA의 분리 및 정제

5. 추가하다 280시약 완충액의 μl b, 10RNase A의 μl, 및 10μL의 단백질 효소 k 미토콘드리아를 함유 한 원심 분리 튜브에. 철저히 믹스를 반전시킵니다, 소화 65℃ ~을 위한 5 분.
6. 추가하다 300시약 완충액의 μl c 용해물에 넣고 잘 섞는다. 흰색 침전물이 나타나는 경우, 방해받지 않고 그대로 둘 수 있어; 실종은 후속 실험에 영향을 미치지 않습니다.
7. 추가하다 300무수 에탄올 μl 그리고 잘 섞어주세요. 강수량을 유발할 수 있습니다, 하지만 후속 실험에는 영향을 미치지 않습니다..
8. 얻어진 액체를 DNA 추출 정제 컬럼으로 옮깁니다. (세트) (매번 약 650~700μl). 더 많은 원심 분리 8,000 rpm 1 분, 수거된 폐기물을 폐기하다, 다음 단계를 위해 수집 튜브를 정제 컬럼에 다시 삽입합니다..
9. DNA 추출 정제 컬럼을 배치합니다. (세트) 수집 튜브로, 추가하다 300세척 완충액의 μl 1, 이상의 원심분리기 8,000 rpm 1 분, 폐기물을 버리다, DNA 추출 정제 컬럼을 다시 삽입합니다. (세트) 다음 단계를 위해 튜브에.

(메모: 절대 에탄올이 세척 완충액에 첨가되었는지 확인하십시오. 1.)

10. 추가하다 400세척 완충액의 μl 1 DNA 추출 정제 컬럼으로 (세트), 원심분리기 14,000 rpm (20,000×g) ~을 위한 2 분. 건조기 막에 대해 원심 분리 시간을 적절하게 연장합니다.
11. DNA 추출 정제 컬럼을 배치합니다. (세트) 새 원심분리기 튜브에, 모자를 엽니 다, 그리고 인큐베이션 65℃ ~을 위한 2 분. 잔류 에탄올이 다운 스트림 실험에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 에탄올을 완전히 증발시키는 데 필요에 따라이 단계를 연장합니다..
12. 드립-스펜드 50-100용출 완충액 μl 멤브레인 위에, 원심분리기 12,000 rpm 2 분.

(메모: 1. 50μL의 용리 완충제로 DNA를 용리하면 DNA 농도를 증가 시키지만 총 수율을 줄일 수 있습니다.; 2. 용리 된 DNA 세척은 추가 수집을 위해 DNA 추출 정제 컬럼에 다시 적용 할 수 있습니다. 12,000 rpm 2 DNA 수율을 높이기위한 분.)