Solarbio Annexin v PE/7-AADアポトーシス検出キット

製品概要

製品導入:

• 細胞膜表面でアポトーシスの初期の変化が発生します.
• これらの変化の1つは、ホスファチジルセリンの移動です (詩) 細胞膜の内側から外側まで, 外面にPSを露出させます.
• PSは、主に細胞膜の内面に見られる負に帯電したリン脂質です.
• アポトーシス中, リン脂質分布の非対称性が破壊されます, PSを外部的に露出させます.
• アネキシンvはPSに簡単に結合し、それに高い親和性を持っています, 細胞膜表面でPSを検出するための敏感なプローブにする.
• PS外膜への移動はアポトーシスに排他的ではありませんが、細胞壊死でも発生する可能性があります.
• 重要な違いは、細胞膜がアポトーシスの初期段階でそのままのままであることです, 一方、初期の細胞壊死では妥協されます.
• したがって, アネキシンVと7-AADの二重染色方法を利用して、フローサイトメトリーを介して初期の細胞アポトーシスを検出できます.

シスプラチンとアポトーシスを誘導した後、アネキシンV-PE/7AADを使用したジュラカット細胞のフローサイトメトリー分析

動作方法: (参照のみ)

1. 細胞サンプルの調製：
2. 接着細胞用: 細胞培地を慎重に集めて遠心管に収集して、後でEDTAなしでトリプシンで細胞を消化します. セルをピペットまたはピペットの先端で優しくピペットダウンできるとき, 以前に収集した細胞培養溶液を追加します, すべての接着セルをピペットにします, そして、セルを優しく吹き飛ばします. 遠心管に再び集めます. 約での遠心 1000 の回転数 5 セルをペレットする数分. 特定のセル用, 細胞を遠心管の底に完全に遠心分離できない場合, 遠心分離時間を適切に延長するか、遠心力をわずかに増加させることができます. 上清を慎重に吸引します. 約50μlの培養液が残り、細胞の吸引を避けることができます. 約1mlの4℃の事前冷却PBSを加えます, セルを再懸濁します, 再び遠心分離して細胞をペレットします, そして、上清を注意深く吸引します;
3. 懸濁細胞用: 約での遠心 1000 の回転数 5 セルをペレットする数分. 特定のセル用, 細胞を遠心管の底に完全に遠心分離できない場合, 遠心分離時間を適切に延長するか、遠心力をわずかに増加させることができます. 細胞の吸引を避けるために残ることができる約50μlの培養液を慎重に吸引する. 約1mlの4℃の事前冷却PBSを加えます, セルを再懸濁します, 再び遠心分離して細胞をペレットします, そして、上清を注意深く吸引します;
4. 結合バッファーを希釈します 1:3脱イオン水で (4ML 4Xバインディングバッファー + 12ML脱イオン水);
5. 1x結合バッファーで細胞を再懸濁し、濃度を1-5×106/mlに調整します;
6. 100µlのセルサスペンションを5mlのフローチューブに入れてください, 5µlのアネキシンV/PEを加えてよく混ぜます, そして、インキュベートします 5 暗闇の中の室温での分;
7. 20 g/ml 7aad 10µlと400µlのPBSを追加して、流れ検出を実行します

実験デザイン:

1. トランスフェクトされていない細胞

• ブランクチューブ: 陰性対照細胞, アネキシンV/PEなし, 7非常に, 電圧を調整するために使用されます.
• 単一の染色チューブ: 陽性対照細胞, アネキシンV/PEまたは調整と補償のための7AADのみでのみ.
• 検出チューブ: 処理された細胞, アネキシンV/PEを追加します, 7非常に. 空白のチューブと単一の染料チューブで電圧補償を調整した後, 必要なフローデータを取得できます.

2. GFPによるトランスフェクション

• トランスフェクトされていないブランクチューブ: トランスフェクトされていない細胞, アネキシンV/PEなし, 7非常に, 電圧を調整するために使用されました.
• トランスフェクトされていない単一染色チューブ: 明らかなアポトーシスを持つ非トランスフェクト細胞の場合, 調整と補償のためにアネキシンV/PEまたは7AADのみを追加する.
• GFPブランクチューブのトランスフェクション: アネキシンV/PEなしでGFPコントロール細胞をトランスフェクトします, 7調整と補償のためのAAD.
• 検出チューブ: 処理された細胞, プラスアネキシンV/PE, 7非常に. 電圧補正を調整した後, 必要なストリーミングデータを取得します.

予防:

1. Annexinvは、ホスファチジルセリンと互換性があります (詩), PSは異なる種に違いはありません. 正常な細胞で, PSは、細胞膜の脂質二重層の内側にのみ分布しています. アポトーシスの初期段階, PSは脂質膜の内側から外側に変わります.
2. 低濃度トリプシンで消化します, 接着細胞を優しく吹き飛ばします 2 に 3 回, 4°Cで遠心分離します 1000 の回転数 5 分, 適切に処理されている場合, トリプシンによって引き起こされる損傷は、内部で制御できます 5%. 対照群がある場合, 実験結果は重要ではありません
3. 最初にPIを追加します. 染色が均一で十分であるかどうかを判断することは難しいだけではありません。, しかし、PI自体は細胞に対しても毒性があり、パンクレアチンよりも実験結果に大きな影響を与えるでしょう. これは推奨されません.
4. AnnexinvはCa依存性タンパク質です, したがって、EDTAがCaイオンのキレートを防ぐためにEDTAを追加することはできません。, それにより、に影響します
5. フローサイトメトリーを使用してアポトーシスを検出する場合, 7AADは時間によって大きな影響を受けます. 7AADにラベルが付けられているためです, それは細胞毒性を増加させます. 時間が経つにつれて, 7AADの染色が増加します, 特に早期アポトーシスを検出する場合. フローサイトメーターの細胞集団間のギャップを増加させることに加えて, エラーは大幅に増加します. 一般的に, 7AADが追加され、マシンはすぐにマシン上にあります, そして、両方の方法でテストが完了します。, しかし、操作手順に従うことによって引き起こされるエラーは小さくなります.

関連文献:

[1] Ruifeng Zhao, ジンジン, Xinyu Sun, 他. クローン由来の鶏肉胚線維芽細胞株の確立 (CSC) フィーダーセルとしてのトランスフェクション効率と能力が高い. Journal of Cellular Biochemistry. 8月 2018. (もし 2.959)