Solarbio lattato deidrogenasi (LDH) Kit di analisi dell'attività

Lattato deidrogenasi (LDH) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Lettore spettrofotometro/micropiastre

Gatto n: BC0685

Misurare:100T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: 60 ml×1. Conservazione a 4 ℃；

Reagente I: 7 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente II: polvere × 1. Conservazione a -20 ℃. Soluzione funzionante: dissolve with 1.3 ml di acqua distillata prima dell'uso. It can be divided into tubule after matching, which can be preserved for two weeks at -20℃. Avoid repeated freeze and thaw cycles.

Reagente III: 7 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente IV: 25 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Sodium pyruvate standard solution: 1 ml (2 µmol/ml) ×1. Conservazione a 4 ℃.

Descrizione del prodotto:

Lactate dehydrogenase (LDH or LD) is the terminal enzyme of the glycolysis pathway which is found in nearly all living cells (animali, impianti, and prokaryotes). LDH catalyzes the conversion of lactate to pyruvic acid and back, as it converts NAD+ to NADH and back.

NAD+ and lactic acid are oxidized to pyruvic acid by the catalysis of LDH. Pyruvate further reacted with 2,4-dinitrophenylhydrazide to form pyruvate dinitrobenzone, which show brown red color in alkaline solution and the color depth is proportional to the concentration of pyruvate.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:

Spettrofotometro/lettore di micropiastre, thermostat water bath, centrifuga da tavolo, pipetta regolabile, microcuvetta in vetro/piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, mortaio/omogeneizzatore, ghiaccio, acqua distillata.

Procedura:

IO. Campione preparazione:

1. Batteri, cellule, or tissue sample:

Batteri o cellule:

Raccolta di batteri o cellule nella provetta da centrifuga. The liquid in the upper layer is discarded after centrifugation. The ratio of bacteria/cell amount (104): Estrarre il volume della soluzione (ml) è 500 ~ 1000:1(Si suggerisce di prendere 5 milioni di batteri/cellula e aggiungere 1 ml di soluzione di estratto). Bacteria and cell is split by ultrasonic (posto sul ghiaccio, 200W, tempo di lavoro 3 secondi, intervallo 10s, ripetere per 30 volte). Centrifugare a 8000 rpm 4℃ for 10 minuti, take the supernatant and put it on ice for test.

Tessuto:

L'omogeneità del bagno di ghiaccio è condotta in base al rapporto della massa tissutale (G): Estrarre il volume della soluzione (ml) = 1: 5~10 (it is recommended to take about 0.1 g di tessuto e aggiungere 1 ml di soluzione di estratto). Ice bath homogenization. Centrifugare a 8000 giri al minuto e 4 ℃ per 10 minuti, take the supernatant and put it on ice for test.

2. Siero (plasma)campione:

Detect sample directly.

II. Procedura:

1. Preheat the Spectrophotometer/Microplate reader 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 450 nm, azzerare con acqua distillata.
2. Sodium pyruvate standard solution: Prendere 100 μL di soluzione standard, dilute to 1, 5, 0.25, 0.125, 0 µmol/ml, and use 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 μmol/mL as standard curve.

3. Sample Test

Nome del reagente (μL)	Provetta(At)	Tubo di controllo(Ac)	Tubo standard(As)
Campione	10	10	–
Soluzione standard	–	–	10
Reagente I	50	50	50
Reagente II	10	–	–
Acqua distillata	–	10	10
Mixed thoroughly, incubate at 37℃(mammifero) o 25 ℃(altre specie) bagnomaria per 15 minuti.
Reagente III	50	50	50
Mixed thoroughly, incubate at 37℃(mammifero) o 25 ℃(altre specie) bagnomaria per 15 minuti.
Reagente IV	150	150	150

Mixed thoroughly, place at room temperature for 3 minuti. Prendere 200 μL of reaction solution in micro glass cuvette/96 well flat-bottom plate, measured the absorbance at 450 nm, ΔA=AT-AC. Each test tube should set a control tube.

III. LDH Calcoli.

1. Sample Sodium pyruvate content
2. Set the standard curve, y-axis as the standard concentration, µmol/ml, x-axis as the 450 nm absorption. Put ΔA(X) into standard curve, calculate y(µmol/ml)
3. Siero (plasma) sample LDH activity

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the producing of 1 nmol of pyruvic acid per minute, every milliliter of serum.

LDH(U/ml)=y÷T×103=66.7×y

4. Tessuto, bacteria or cultured cells LDH activity

UN. Concentrazione proteica:

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the producing of 1 nmol of pyruvic acid per minute, ogni milligrammo di proteine.

LDH(U/mg prot)= y÷T÷Cpr×103 =66.7×y÷Cpr

B. Peso del campione

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the producing of 1 nmol of pyruvic acid per minute, in every gram of tissue. LDH(U/g)= y÷T÷W×103 =666.7×y

C. Quantità di celle

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the producing of 1 nmol of pyruvic acid per minute every 10000 cellule.

LDH(U/104 cella)= y÷T÷500×103 =0.133×y

Contro: Supernate volume (ml), 0.01 ml; Vsv: Estrarre il volume della soluzione, 1 ml; T: Tempo di reazione, 15 minuti;

Cpr: Concentrazione proteica del campione, mg/ml; W: Peso del campione, 0.1 G;

500: Numero totale di batteri o cellule, 5 milioni; 103: 1 μmol/mL=103 nmol/mL.

Riferimenti

[1] Huang P H, Fu L C, Huang C S, et al. The uptake of oligogalacturonide and its effect on growth inhibition, lactate dehydrogenase activity and galactin-3 release of human cancer cells[J]. Food chemistry, 2012, 132(4): 1987-1995.

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