Perossido di idrogeno Solarbio (H2O2) Kit di analisi del contenuto

Componenti:

Reagente I: Acetone 100 ml×1. Conservazione a 4 ℃. (Reagente autofornito)

Reagente Ⅱ: Polvere×1. Conservazione a 4 ℃. Soluzione funzionante: Aggiungere 3 ml di acido cloridrico concentrato (37%) prima dell'uso, completamente disciolto. Reagenti non utilizzati conservati presso 4 °C.

Reagente Ⅲ: 6ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente Ⅳ: 30ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Standard: 1ml×1, 1mmol/ml di soluzione standard H2O2. Conservazione a 4 ℃.

Descrizione del prodotto:

H2O2 è la molecola reattiva dell'ossigeno più comune negli organismi. È prodotto principalmente dalla catalizzazione di SOD e XOD e degradato dalla catalizzazione di CAT e POD. H2O2, che non è solo uno degli importanti ossigeno reattivo, ma anche il fulcro della mutua conversione dell'ossigeno reattivo. Da un lato, L'H2O2 può ossidare direttamente o indirettamente gli acidi nucleici intracellulari, proteine ​​e altre macromolecole biologiche, e danneggiare le membrane cellulari, accelerando così l’invecchiamento e la disintegrazione delle cellule. D'altra parte, L’H2O2 è anche un fattore regolatore chiave in molte reazioni di emergenza ossidativa.

H2O2 e solfato di titanio generano un complesso giallo di perossido di titanio con il caratteristico assorbimento a 415 nm.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti.

Lettore spettrofotometro/micropiastre, centrifuga da tavolo, pipetta regolabile, microcuvetta in vetro/piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, pipetta di trasferimento, acido solforico concentrato in acetone (37% HCl), malta e ghiaccio.

Procedura:

IO. Estrazione del campione:

1. 1. Campione batterico o cellulare: raccogliere il campione batterico o cellulare da centrifugare, scartare il surnatante; suggerito 5 milioni con 1 ml di Regent I, dividendo batteri e cellule con ultrasuoni (energia 20%, tempo di lavoro 3 secondi, intervallo 10s, per 30 volte); centrifugare a 8000g e 4℃ per 10 min, il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.
   2. Tessuto: prendere 0,1 g di tessuto aggiungere 1 ml reggente I, macinazione completa su ghiaccio. Centrifugare a, 8000ge 4℃per 10 min, il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.
   3. Siero: in base alla proporzione di per 100μL di siero (plasma) aggiungere 0,9 ml di reggente I, mescolare bene. Centrifugare a 8000 g e 4 ℃ per 10 min, il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.

II. Determinazione procedura:

• Preriscaldare lo spettrofotometro/lettore di micropiastre per 30 min, regolare la lunghezza d'onda su 415 nm, azzerare con acqua distillata.
• Soluzione di incubazione Ⅱ, Ⅲ e Ⅳ a 37 ℃(mammiferi) o 25 ℃ (altri animali) bagnomaria per più di 10 minuti minuti.
• Soluzione di lavoro standard: Se si utilizza una piastra da 96 pozzetti, diluire la soluzione standard da 1 mmol/ml in una soluzione standard da 2μmol/ml con acetone, e utilizzare un metodo colorimetrico in vetro in tracce per diluire 1mmol/ml di soluzione standard in 1μmol/ml di soluzione standard
• Aggiungere i reagenti con il seguente elenco (reazione in provetta EP):

Aggiungere Regent Ⅳ per sciogliere il precipitato (il passaggio può rimuovere il pigmento vegetale con acetone 3-5 volte), e posizionarlo a temperatura ambiente per 5 min, Trasferire 200 μL in una microcuvetta di vetro o in una piastra da 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 415 nm. La provetta di controllo deve essere testata solo una o due volte. Calcolare ∆AT =AT-AC, ∆AS=AS-AC.

III. Calcolo (Per micropiastra lettore)

UN. 96-BENE piatto

• Quantità di celle

H2O2(μmol /104 cella) = ∆AT÷(∆AS÷C)×Vs÷(500×Vs÷Ve)=0,004 × ∆AT ÷ ∆AS

• Peso del campione

H2O2(µmol/g)= ∆AT÷(∆AS÷C)×V1÷(Vs÷Ve×W)= 2×∆AT ÷ ∆AS ÷ W

• Concentrazione proteica

H2O2(μmol/mg prot)= ∆AT ÷(∆AS÷C)×Vs÷(Cpr×Vs)= 2×∆AT÷ ∆AS ÷ Cpr

• Siero (plasma)volume

H2O2(µmol/ml)= ∆AT ÷(∆AS÷C)×10=20 × ∆AT÷ ∆AS

500: quantità di cellule o batteri, 104;

C: concentrazione della soluzione standard di H2O2, 2µmol/ml;

Contro: volume del campione, 0.25 ml; W: Peso del campione, G;

Ve: volume di estrazione, 1 ml;

Cpr: concentrazione delle proteine ​​del campione, mg/ml;

10: diluizione del siero multipla. [0.1ml di siero (plasma)+0.9ml reggente I]÷0,1 ml di siero(plasma)=10.

B. microvetro cuvetta:

Modificare la concentrazione dello standard C-2μmol/mL nella formula sopra in C-1μmol/mL per il calcolo.

Nota:

1. Come soluzione, Sono facilmente volatile, La soluzione I deve essere preraffreddata prima dell'uso. Deve essere macinato sul ghiaccio durante la macinazione.
2. La soluzione contenuta in questo kit è facilmente volatile. Si prega di portare guanti e mascherine monouso.
3. Se il valore di assorbanza del campione è maggiore di 1.1, si consiglia di diluire il campione con il Reagente I prima di eseguire la misurazione.

Esempi sperimentali:

1. Prendere 0.1 g di cuore e aggiungere 1 ml di reagente I per l'elaborazione del campione. Dopo la centrifugazione prelevare tutto il surnatante, procedere secondo la procedura di determinazione. Dopo la determinazione con 96 piastra a fondo ben piatto, calcolare ∆AT=AT-AC=0,083-0,046=0,039, ∆AS=AS-AC=0,824-0,046=0,778. Il contenuto viene calcolato in base alla massa del campione.

H2O2(µmol/g) =2×∆AT ÷ ∆AS ÷ W =1 μmol/g.

2. Prendere 0.1 g di tè e aggiungere 1 ml di reagente I per l'elaborazione del campione. Dopo la centrifugazione prelevare tutto il surnatante, procedere secondo la procedura di determinazione. Dopo la determinazione con 96 piastra a fondo ben piatto, calcolare ∆AT=AT-AC=0,258-0,003=0,255, ∆AS=AS-AC=0,637-0,003=0,634. Il contenuto viene calcolato in base alla massa del campione.

H2O2(µmol/g) =2×∆AT ÷ ∆AS ÷ W =4,5 μmol/g.

Riferimenti：

• Satterfield C N, Bonnell A interferenza nel metodo del solfato di titanio per il perossido di idrogeno[J].

Chimica Analitica, 1955, 27(7): 1174-1175.

• Amin V M, Olson N F. Determinazione spettrofotometrica dell'acqua ossigenata nel latte[J]. Giornale di scienza lattiero-casearia, 1967, 50(4):461-464.
• Sima Y H, YaoJM, Amore Y S, et al. Variazioni dell'espressione del perossido di idrogeno e della catalasi nelle uova di Bombyx durante l'inizio e la fine della diapausa[J]. Archivi di biochimica e fisiologia degli insetti, 2011, 77(2): 72-80.

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Specifiche tecniche:

Limite di rilevamento ：0.0027 µmol/ml

Gamma lineare：0.0195-3 µmol/ml