Réaction en chaîne par polymérase (RAP) a révolutionné la recherche et les diagnostics en biologie moléculaire. Cette technique polyvalente permet une amplification exponentielle des séquences d'ADN cibles en quelques heures seulement. Mais comment savez-vous si votre PCR a fonctionné? Et si vous avez généré le produit attendu, Comment pouvez-vous déterminer sa taille précise? C'est là que les échelles d'ADN entrent.
Qu'est-ce qu'une échelle d'ADN?
Une échelle d'ADN contient des fragments d'ADN de connu, tailles spécifiques. Tout comme une règle avec des marques en pouces ou centimètres, Une échelle d'ADN agit comme une référence de taille lors de l'électrophorèse sur gel d'exécution. En comparant vos groupes d'échantillons de PCR aux fragments d'échelle, Vous pouvez estimer la taille de vos fragments d'ADN inconnus.
Les échelles d'ADN sont composées de molécules d'ADN allant de 100 Paires de bases à plus 10,000 paires de bases. Les fragments sont souvent des multiples de 100 ou 1,000 paires de bases. Échelles avec des intervalles de 100 BP est le meilleur pour déterminer la taille des petits produits de PCR, alors que 1 Les échelles KB fonctionnent mieux pour les plus grands amplicons.
Comment une échelle d'ADN est-elle fabriquée?
Tandis que les échelles prêtes à l'emploi peuvent être achetées, Vous pouvez également créer votre échelle d'ADN dans le laboratoire. Voici quelques méthodes de préparation courantes:
- Digestion enzymatique de restriction de ADN plasmidique– Les plasmides sont coupés avec des enzymes comme hindiii ou ecori pour libérer des fragments de taille spécifique.
- Amplification par PCR– Les séquences cibles des longueurs variables sont amplifiées individuellement puis combinées en échelle.
- Digestion partielle des concatamères– Les répétitions en tandem d'une séquence d'ADN sont clivées pour produire des multimères.
- Hybridation synthétique oligonucléotidique– De courts fragments d'ADN simple brin sont recuits en multimères double brin.
Peu importe la méthode de production, La clé est de générer un ensemble de bandes discrètes couvrant la plage de taille souhaitée.
Comment une échelle d'ADN est-elle utilisée?
Maintenant que vous comprenez ce qu'est une échelle d'ADN, Comment est-il utilisé? Les échelles d'ADN servent deux objectifs essentiels:
1. Estimation de la taille
En exécutant une échelle d'ADN aux côtés de vos échantillons de PCR sur un gel d'agarose ou de polyacrylamide, Vous pouvez estimer la taille de vos fragments d'ADN inconnus.
Pendant l'électrophorèse, L'échelle et les échantillons migrent à travers la matrice de gel à des taux dépendants de leur taille. De petits fragments se déplacent plus loin dans le gel, Alors que les fragments plus grands sont en retard.
Lorsque l'ADN est coloré et visualisé, Les fragments d'échelle apparaissent comme nets, bandes discrètes. En alignant vos échantillons de bandes avec des bandes d'échelle de taille correspondante, Vous pouvez déterminer la longueur approximative de vos produits PCR.
2. Contrôle de qualité
L'inclusion d'une échelle d'ADN sert également de contrôle visuel que votre amplification PCR a fonctionné. Lorsque vous observez des bandes d'échantillons distinctes migrant aux positions attendues par rapport à l'échelle, Cela donne une confirmation rapide que votre PCR a réussi.
Si vous ne voyez pas de groupes, L'échelle indique que l'électrophorèse elle-même a été effectuée correctement. Cela suggère que votre réaction de PCR peut avoir échoué et le dépannage est nécessaire.
Quelle taille d'échelle d'ADN devrais-je utiliser?
Avec la variété des échelles d'ADN disponibles, Comment choisissez-vous le bon pour votre expérience? Voici les facteurs clés à considérer:
- Plage de taille– La gamme d'échelle doit englober vos tailles de produit PCR attendues. Pour les amplicons sous 1 ko, un 100 BP ou 1 L'échelle KB convient. Pour les plus grands produits, Choisissez une échelle plus élevée comme 5 kb ou 10 ko.
- Espacement des bandes– Les échelles avec plus de bandes de référence dans une plage de taille donnée permettent une plus grande précision de dimensionnement. Cependant, Les bandes étroitement espacées prennent plus de temps à résoudre pleinement. Si le temps est limité ou si vous n'avez besoin que de tailles approximatives, Utilisez une échelle avec moins de fragments.
- Prêt à charger– Préfabriqué, Les échelles prêtes à chargement garantissent les intensités précises du groupe. Évitez de diluer ou de mélanger les échelles vous-même.
- Numéro d'échantillon– Pour plusieurs échantillons, Choisissez une plus grande taille de piste d'échelle pour permettre une comparaison côte à côte.
- Budget – Considérez le coût si la production de grands volumes de gels. Certaines échelles sont plus économiques.
Comment lire une échelle d'ADN?
Une fois votre gel visualisé après électrophorèse, Comment lisez-vous l'échelle pour déterminer les tailles de produits PCR? Suivez ces étapes:
- Identifiez les voies contenant les fragments d'échelle d'ADN. Ceci est généralement chargé dans la première et / ou la dernière voie.
- Remarquez la taille des bandes d'ADN de paire de bases en fonction du graphique de référence du fabricant d'échelle. Les échelles sont codées par couleur pour une lecture facile.
- Comparez vos échantillons de bandes inconnues à l'échelle, Identifier la bande la plus proche de la voie d'échelle. La taille de votre groupe est approximative de ce fragment d'échelle.
- Pour une plus grande précision, Taille de la bande interpolée entre deux fragments d'échelle. Par exemple, Si votre groupe fonctionne entre le 500 et 600 bandes d'échelle BP, estimer sa taille comme 550 pb.
- Pour augmenter la précision de la dimensionnement, faire fonctionner les gels plus longtemps pour maximiser la séparation entre les bandes d'échelle. Le chargement de plus petites quantités d'échelle peut également améliorer la résolution de la bande.
Quels sont quelques exemples d'échelles d'ADN couramment utilisées?
De nombreux types d'échelles d'ADN sont disponibles auprès de fabricants comme la Nouvelle-Angleterre Biolabs, Thermochisher, et Invitrogen. Certaines options couramment utilisées incluent:
- 100 échelle d'ADN BP – Contient 12 fragments de 100 BP à 1,500 pb. Idéal pour les produits PCR sous 1,000 pb.
- 1 échelle d'ADN KB– Composé de 13 des groupes de 250 BP à 10,000 pb. Bien adapté aux amplicons jusqu'à 10 ko.
- 1 Échelle d'ADN KB plus– Version élargie de 1 échelle KB avec fragments de poids moléculaire élevés et faibles supplémentaires.
- Échelle d'ADN rapide– Échelle pré-digérée prête pour le chargement direct sur les gels. Moins de bandes permettent des temps d'exécution rapides.
- Échelle d'ADN à poids moléculaire élevé – Contient des fragments d'ADN plus grands jusqu'à 48,500 BP pour dimensionner l'ADN génomique de poids moléculaire élevé.
Comment préparer et charger une échelle d'ADN?
Pour exploiter tous les avantages de votre échelle d'ADN, Les techniques de préparation et de chargement appropriées sont essentielles:
- Vérifiez l'intégrité de l'échelle avant utilisation – Inspectez toute tracture ou dégradation de la bande.
- Mélanger doucement – Évitez le vortex vigoureux pour éviter le cisaillement de l'ADN.
- Utiliser des montants recommandés par le fabricant – Le sous-chargement donne une faible intensité de bande. La surcharge provoque la saturation.
- Chargeur de chargement dans la première et / ou la dernière voie – Fournit une référence de taille des deux côtés de vos échantillons.
- Inclure une voie sans échelle – Sert de contrôle de la contamination.
Suivre ces meilleures pratiques vous donnera des performances d'échelle optimales à chaque fois.
Comment créer mon échelle d'ADN?
Alors que l'achat d'échelles préfabriquées est l'itinéraire le plus simple, Vous pouvez également faire votre échelle d'ADN en utilisant la PCR et la digestion des restrictions. Voici un aperçu du processus:
- Concevoir des amorces de PCR pour amplifier des séquences cibles spécifiques de longueurs variables, tel que 500, 750, 1,000, et 1,500 pb.
- Exécutez des PCR individuelles en utilisant chaque paire d'amorces pour générer des fragments d'ADN d'une taille définie.
- Purifiez les produits de PCR et quantifier la concentration d'ADN pour chaque fragment.
- Digérer les fragments avec la même enzyme de restriction pour générer des extrémités collantes compatibles.
- Mélanger les fragments dans des rapports molaires spécifiques pour atteindre les intensités de bande souhaitées.
- Lignez les fragments pour former des multimères séparés par des sites de restriction.
- Amplifiez l'utilisation d'amorces universelles pour générer des concatamères.
- Digérer partiellement les concatamères avec une enzyme de restriction originale à couper sur les sites internes.
- Purifiez et mélangez les digestions dans votre échelle d'ADN finale.
Pourquoi les échelles d'ADN sont-elles si importantes pour la PCR?
Les échelles d'ADN sont essentielles pour la réaction en chaîne par polymérase (RAP) Applications pour plusieurs raisons clés:
Précision et reproductibilité
Les échelles d'ADN permettent un dimensionnement précis et une reproductibilité cohérente des résultats de la PCR. En comparant vos groupes aux normes de poids moléculaire de l'échelle, Vous pouvez déterminer avec précision la taille de l'amplicon et confirmer une amplification cible réussie. Cela permet de se reproduire de manière fiable des résultats entre différents utilisateurs, équipement, et laboratoires.
Standardisation
Y compris une échelle d'ADN standardise les comparaisons entre plusieurs échantillons de PCR. Que vous analysiez différentes conditions d'un échantillon ou de dépistage de nombreux spécimens de patients, L'échelle fournit une référence constante pour évaluer les résultats. La normalisation est essentielle pour la cohérence dans la recherche et les diagnostics cliniques.
Optimisation
Les échelles facilitent l'optimisation de la PCR en indiquant si l'amplification se produit comme prévu. Les tailles de bande inattendues ou la faible intensité révèlent des conditions sous-optimales. L'échelle aide à dépanner les protocoles pour dériver les meilleures amorces, cyclistes, et la pureté de l'échantillon.
Sensibilité
Avec une échelle à large gamme, Même les bandes de PCR faibles peuvent être visualisées et dimensionnées. Cela permet la détection de copies de modèles bas critiques pour les applications telles que la surveillance de la charge virale. La sensibilité fournie par une échelle prend en charge l'utilisation de la PCR dans la détection d'une seule molécule.
Multiplexage
Pour la PCR multiplex avec plusieurs ensembles d'amorces, Les échelles vérifient l'identité de chaque bande cible. Cela permet une amplification efficace de plusieurs séquences dans une réaction.
Automation
Les échelles d'ADN permettent une analyse logicielle automatique des gels PCR. Les algorithmes informatiques s'appuient sur l'échelle pour normaliser les différences de migration de la bande entre les gels. Cela permet un grand débit, Analyse rapide des grands nombres d'échantillons.
En bref, Les échelles d'ADN autorisent la PCR avec précision, reproductibilité, standardisation, optimisation, sensibilité, capacité de multiplexage, et l'automatisation. Que vous perfectionnez un nouveau protocole ou que vous analysiez des échantillons cliniques, Cet outil essentiel amplifiera votre succès et soutiendra d'excellents résultats de recherche.
