Reaksi berantai polimerase (PCR) telah merevolusi penelitian dan diagnostik biologi molekuler. Teknik serbaguna ini memungkinkan amplifikasi eksponensial dari urutan DNA target hanya dalam beberapa jam. Tapi bagaimana Anda tahu jika PCR Anda berhasil? Dan jika Anda menghasilkan produk yang diharapkan, Bagaimana Anda bisa menentukan ukurannya yang tepat? Di sinilah tangga DNA masuk.
Apa itu tangga DNA?
Tangga DNA berisi fragmen DNA yang diketahui, Ukuran tertentu. Sama seperti penguasa dengan tanda dalam inci atau sentimeter, Tangga DNA bertindak sebagai referensi ukuran saat menjalankan elektroforesis gel. Dengan membandingkan pita sampel PCR Anda dengan fragmen tangga, Anda dapat memperkirakan ukuran fragmen DNA Anda yang tidak diketahui.
Tangga DNA terdiri dari molekul DNA mulai dari 100 pasangan basa untuk lebih 10,000 pasangan basa. Fragmen -fragmen itu sering kelipatan 100 atau 1,000 pasangan basa. Tangga dengan interval 100 BP adalah yang terbaik untuk menentukan ukuran produk PCR kecil, ketika 1 Tangga KB bekerja lebih baik untuk amplikon yang lebih besar.
Bagaimana tangga DNA dibuat?
Sementara tangga siap pakai dapat dibeli, Anda juga dapat membuat tangga DNA Anda di lab. Berikut adalah beberapa metode persiapan umum:
- Pembatasan pencernaan enzim DNA plasmid– Plasmid dipotong dengan enzim seperti hindiii atau ecori untuk membebaskan fragmen berukuran tertentu.
- Amplifikasi oleh PCR– Urutan target dengan panjang yang bervariasi diamplifikasi secara individual dan kemudian digabungkan menjadi tangga.
- Pencernaan sebagian concatamers– Pengulangan tandem dari urutan DNA dibelah untuk menghasilkan multimer.
- Hibridisasi oligonukleotida sintetis– Fragmen DNA untai tunggal pendek dianil menjadi multimer untai ganda.
Tidak peduli metode produksinya, Kuncinya adalah menghasilkan satu set pita diskrit yang mencakup kisaran ukuran yang diinginkan.
Bagaimana tangga DNA digunakan?
Sekarang Anda mengerti apa tangga DNA, Bagaimana cara digunakan? Tangga DNA melayani dua tujuan penting:
1. Estimasi ukuran
Dengan menjalankan tangga DNA di samping sampel PCR Anda pada gel agarosa atau poliakrilamida, Anda dapat memperkirakan ukuran fragmen DNA Anda yang tidak diketahui.
Selama elektroforesis, Tangga dan sampel bermigrasi melalui matriks gel dengan harga tergantung pada ukurannya. Fragmen yang lebih kecil melakukan perjalanan lebih jauh ke bawah, sedangkan fragmen yang lebih besar lag.
Saat DNA diwarnai dan divisualisasikan, Fragmen tangga tampak tajam, pita diskrit. Dengan mengantre contoh pita Anda dengan pita tangga dengan ukuran yang cocok, Anda dapat menentukan perkiraan panjang produk PCR Anda.
2. Kontrol Kualitas
Dimasukkannya tangga DNA juga berfungsi sebagai kontrol visual yang dikerjakan oleh amplifikasi PCR Anda. Saat Anda mengamati pita sampel berbeda yang bermigrasi pada posisi yang diharapkan relatif terhadap tangga, Ini memberikan konfirmasi cepat bahwa PCR Anda berhasil.
Jika Anda gagal melihat band apa pun, Tangga menunjukkan bahwa elektroforesis itu sendiri dilakukan dengan benar. Ini menunjukkan reaksi PCR Anda mungkin gagal dan pemecahan masalah diperlukan.
Berapa ukuran tangga DNA yang harus saya gunakan?
Dengan variasi tangga DNA yang tersedia, Bagaimana Anda memilih yang tepat untuk percobaan Anda? Berikut adalah faktor utama yang perlu dipertimbangkan:
- Kisaran ukuran– Rentang tangga harus mencakup ukuran produk PCR yang Anda harapkan. Untuk amplikon di bawah 1 kb, A 100 bp atau 1 Tangga KB cocok. Untuk produk yang lebih besar, Pilih tangga yang lebih tinggi 5 KB atau 10 kb.
- Jarak band– Tangga dengan lebih banyak pita referensi dalam kisaran ukuran tertentu memungkinkan presisi ukuran yang lebih besar. Namun, Pita jarak dekat membutuhkan waktu lebih lama untuk menyelesaikan sepenuhnya. Jika waktu terbatas atau Anda hanya perlu ukuran perkiraan, Gunakan tangga dengan lebih sedikit fragmen.
- Siap-siap– Premade, tangga siap pakai menjamin intensitas pita yang akurat. Hindari menipiskan atau mencampur tangga.
- Nomor sampel– Untuk beberapa sampel, Pilih ukuran jalur tangga yang lebih besar untuk memungkinkan perbandingan berdampingan.
- Anggaran – Pertimbangkan biayanya jika menghasilkan volume gel yang besar. Beberapa tangga lebih ekonomis.
Bagaimana cara membaca tangga DNA?
Setelah gel Anda divisualisasikan setelah elektroforesis, Bagaimana Anda membaca tangga untuk menentukan ukuran produk PCR? Ikuti langkah -langkah ini:
- Identifikasi jalur yang berisi fragmen tangga DNA. Ini biasanya dimuat di jalur pertama dan/atau terakhir.
- Perhatikan ukuran pita DNA pasangan dasar berdasarkan bagan referensi produsen tangga. Tangga berkode warna agar mudah dibaca.
- Bandingkan pita sampel Anda yang tidak dikenal dengan tangga, mengidentifikasi band terdekat di jalur tangga. Ukuran band Anda perkiraan fragmen tangga itu.
- Untuk presisi yang lebih besar, Ukuran pita interpolasi antara dua fragmen tangga. Misalnya, Jika band Anda berjalan di antara 500 Dan 600 BP Tangga BP, Perkirakan ukurannya sebagai 550 bp.
- Untuk meningkatkan akurasi ukuran, Jalankan gel lebih lama untuk memaksimalkan pemisahan antara pita tangga. Memuat tangga dalam jumlah yang lebih kecil juga dapat meningkatkan resolusi pita.
Apa saja contoh tangga DNA yang umum digunakan?
Banyak jenis tangga DNA tersedia dari produsen seperti New England Biolabs, Thermofisher, dan Invitrogen. Beberapa opsi yang umum digunakan termasuk:
- 100 Tangga DNA BP – Berisi 12 fragmen dari 100 bp to 1,500 bp. Ideal untuk produk PCR di bawah 1,000 bp.
- 1 Tangga DNA KB– Terdiri dari 13 band dari 250 bp to 10,000 bp. Sangat cocok untuk amplik 10 kb.
- 1 kb plus tangga DNA– Versi yang diperluas dari 1 Tangga KB dengan tambahan fragmen berat molekul tinggi dan rendah.
- Tangga DNA Fastdigest– Tangga yang sudah dicerna siap untuk pemuatan langsung ke gel. Lebih sedikit band yang memungkinkan waktu lari cepat.
- Tangga DNA dengan berat molekul tinggi – Mengandung fragmen DNA yang lebih besar hingga 48,500 BP untuk ukuran DNA genom dengan berat molekul tinggi.
Bagaimana cara menyiapkan dan memuat tangga DNA?
Untuk memanfaatkan manfaat penuh dari tangga DNA Anda, Teknik persiapan dan pemuatan yang tepat adalah kuncinya:
- Periksa integritas tangga sebelum digunakan – Periksa apa pun yang dioleskan atau degradasi band.
- Campur dengan lembut – Hindari vortexing yang kuat untuk mencegah DNA geser.
- Gunakan jumlah yang direkomendasikan pabrikan – Underloading memberikan intensitas pita yang lemah. Kelebihan beban menyebabkan saturasi.
- Muat tangga di jalur pertama dan/atau terakhir – Memberikan referensi ukuran di kedua sisi sampel Anda.
- Sertakan jalur tanpa tangga – Berfungsi sebagai kontrol kontaminasi.
Mengikuti praktik terbaik ini akan memberi Anda kinerja tangga yang optimal setiap saat.
Bagaimana cara membuat tangga DNA saya?
Saat membeli tangga yang sudah dibuat adalah rute termudah, Anda juga dapat membuat tangga DNA Anda menggunakan PCR dan pencernaan pembatasan. Berikut adalah gambaran tentang prosesnya:
- Desain primer PCR untuk memperkuat urutan target spesifik dengan berbagai panjang, seperti 500, 750, 1,000, Dan 1,500 bp.
- Jalankan PCR individu menggunakan setiap pasangan primer untuk menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang ditentukan.
- Purni produk PCR dan ukur konsentrasi DNA untuk setiap fragmen.
- Mencerna fragmen dengan enzim restriksi yang sama untuk menghasilkan ujung lengket yang kompatibel.
- Campur fragmen dalam rasio molar spesifik untuk mencapai intensitas pita yang diinginkan.
- Ligasi fragmen untuk membentuk multimer yang dipisahkan oleh situs pembatasan.
- Memperkuat menggunakan primer universal untuk menghasilkan concatamers.
- Contatamers pencernaan sebagian dengan enzim restriksi asli untuk dipotong di situs internal.
- Purni dan campur pencernaan ke tangga DNA akhir Anda.
Mengapa tangga DNA begitu penting untuk PCR?
Tangga DNA sangat penting untuk reaksi berantai polimerase (PCR) Aplikasi karena beberapa alasan utama:
Akurasi dan reproduktifitas
Tangga DNA memungkinkan ukuran yang akurat dan reproduktifitas hasil PCR yang konsisten. Dengan membandingkan pita Anda dengan standar berat molekul tangga, Anda dapat secara tepat menentukan ukuran amplikon dan mengkonfirmasi amplifikasi target yang berhasil. Ini memungkinkan hasil untuk direproduksi secara andal di berbagai pengguna yang berbeda, peralatan, dan laboratorium.
Standardisasi
Termasuk tangga DNA menstandarkan perbandingan antara beberapa sampel PCR. Apakah Anda menganalisis berbagai kondisi dari satu sampel atau skrining banyak spesimen pasien, Tangga memberikan referensi konstan untuk mengevaluasi hasil. Standardisasi sangat penting untuk konsistensi dalam penelitian dan diagnostik klinis.
Optimasi
Tangga memfasilitasi optimasi PCR dengan menunjukkan apakah amplifikasi terjadi seperti yang diharapkan. Ukuran pita yang tidak terduga atau intensitas lemah mengungkapkan kondisi suboptimal. Tangga membantu dalam pemecahan masalah protokol untuk mendapatkan primer terbaik, kondisi bersepeda, dan kemurnian sampel.
Kepekaan
Dengan tangga jangkauan luas, Bahkan pita PCR yang samar dapat divisualisasikan dan berukuran. Ini memungkinkan deteksi salinan templat rendah yang penting untuk aplikasi seperti pemantauan viral load. Sensitivitas yang disediakan oleh tangga mendukung penggunaan PCR dalam deteksi molekul tunggal.
Multiplexing
Untuk PCR multipleks dengan beberapa set primer, Tangga memverifikasi identitas setiap pita target. Ini memungkinkan amplifikasi yang efisien dari beberapa urutan dalam satu reaksi.
Otomatisasi
Tangga DNA Mengaktifkan Analisis Perangkat Lunak Otomatis Gel PCR. Algoritma komputer mengandalkan tangga untuk menormalkan perbedaan migrasi pita antara gel. Ini memungkinkan throughput tinggi, Analisis Cepat Jumlah Sampel Besar.
Pendeknya, Tangga DNA memberdayakan PCR dengan akurasi, reproduktifitas, standardisasi, optimasi, kepekaan, Kemampuan multiplexing, dan otomatisasi. Apakah Anda menyempurnakan protokol baru atau menganalisis sampel klinis, Alat penting ini akan memperkuat kesuksesan Anda dan mendukung hasil penelitian yang sangat baik.
