Solarbio Hydroxyproline (HYP) Kit de test d'activité

Hydroxyproline (HYP) Kit de test d'activité

Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.

Équipement de détection: Spectrophotomètre/Lecteur de microplaques

Chat non: BC0255

Taille: 100T/96S

 

Composants:

Extraire la solution: 6 mol/L acide chlorhydrique (HCl), réactif fourni soi-même. HCl concentré（ 37%） : H2O(V/V) =1:1, conservé à température ambiante.

Réactif I: 8 mL×1, conserver à 4°C et à l'abri de la lumière. Réactif II: 8 mL×1, conserver à 4°C et à l'abri de la lumière. Standard: 0.5 mL×1, 0.5 mg/mL d'hydroxyproline, conserver à 4℃.

Description:

HYP est l’un des principaux composants du collagène dans le corps. La majeure partie du collagène est distribuée dans la peau, tendon, cartilage, et les vaisseaux sanguins et al. Donc, le contenu en HYP est un indice important reflétant le métabolisme et le degré de fibrose du tissu collagène.

L'échantillon est hydrolysé pour produire du HYP libre, qui est en outre oxydée par la chloramine T. Le produit oxydé a réagi avec le p-diméthylaminobenzaldéhyde pour produire un composé rouge avec un pic d'absorption caractéristique à 560 nm. La teneur en HYP peut être calculée en mesurant la valeur d'absorption de l'hydrolysat de l'échantillon à 560 nm.

Obligatoire mais non fourni:

Balance, four, tube de verre, centrifuger, bain d'eau, spectrophotomètre/lecteur de microplaques, cuvette en verre micro/plaque 96 puits, 6 mol/L HCl et eau distillée.

Procédure:

je. La préparation des échantillons

1. 1. Échantillon de tissu:

Peser environ 0.2 g de l'échantillon dans le tube en verre, couper le tissu en morceaux autant que possible pour la digestion. Ajouter 2 mL de solution d’extrait et le couvercle est légèrement lâche et n’est pas hermétique, faites-le bouillir ou faites-le cuire au four à 110 ℃ pendant 2 à 6 heures pour le digérer jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de gros morceau visible.

Après refroidissement, ajuster le pH à 6-8 avec 10 mol/LNaOH (Ne pas utiliser trop d'acide ou d'alcali) puis volume constant à 4 mL avec de l'eau distillée. Centrifugation à 16000 tr/min pour 20 minutes à 25℃ (s'il reste des impuretés après centrifugation, il peut être éliminé par filtration).

Prenez le surnageant pour le test. (Une substance noire peut se former au cours du processus, et s'il ne peut pas être digéré pendant longtemps, il peut s'agir d'une substance carbonisée. Cela n'affecte pas l'expérience).

2. Cellules:

Prendre 5 millions de cellules, ajouter 1 mL de solution d'extrait, bouillir, ou au four à 110℃ pendant 2 à 6 heures pour digérer jusqu'à l'état transparent.

Après refroidissement, ajuster le pH à 6-8 avec 10 mol/LNaOH (Ne pas utiliser trop d'acide ou d'alcali) puis volume constant à 2 mL avec de l'eau distillée. Centrifugation à 16000 tr/min pour 20 minutes à 25℃ (s'il reste des impuretés après centrifugation, il peut être éliminé par filtration).

Prenez le surnageant pour le test.

II. Détection

1. Préchauffer le spectrophotomètre/lecteur de microplaques pour 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 560 nm et mettre à zéro avec distillé
2. Diluer la solution étalon pour 30, 15, 7.5, 3.75, 1.875, 0.938, 0.469, 0.234 µg/mL.
3. Ajouter les réactifs comme dans le tableau suivant.

Réactif (µL)	Tube vierge (B)	Tube à essai (T)	Tube standard (S)
Échantillon	–	60	–
Standard	–	–	60
Réactif I	60	60	60
Bien mélanger et laisser à température ambiante pendant 20 minutes.
Réactif II	60	60	60
eau distillée	180	120	120

Bien mélanger, incuber à 60℃ pendant 20 minutes, laissez-le à température ambiante pendant 15 minutes, prendre 200 μL de la solution réactionnelle dans une cuvette en verre micro/plaque à fond plat de 96 puits et tester la valeur d'absorbance d'au 560 nm. ΔA = AT – UN B.

III. Calcul

1. Élaboration d'une norme

Lors de la création de la courbe standard, la concentration de la solution étalon est prise comme axe des x, et le ΔAS (ΔAS =AS-AB) est pris comme axe y. L'équation linéaire y=kx+b est obtenue. Prenez ΔAT (ET-AB) à l'équation pour acquérir x.

2. Calcul de la teneur en hydroxyproline:calculé en fonction du poids frais de l'échantillon:

Teneur en hydroxyproline tissulaire (μg/g de poids frais) = x×VS÷(W×VS÷VTE) = 4x÷W.

• Calculé en fonction de la concentration en protéines de l'échantillon:

Teneur en hydroxyproline tissulaire (μg/mg prot) = x×VS÷(Cpr×VS) = x÷Cpr.

• Calculé en fonction du nombre de bactéries ou de cellules:

Teneur en hydroxyproline cellulaire (µg/104 cellule) = x×VS÷(N×VS÷VCE )= 2x÷N.

CONTRE: Volume de l'échantillon ajouté, 0.06 ml;

TEV: Volume de solution d'extrait de tissu, 4 ml; VCE: Volume de solution d'extrait cellulaire, 2 ml;

W: Poids frais de l'échantillon, g;

N: Nombre de cellules,104 en tant qu'unités, 10000;

Cpr: Concentration de la protéine de l'échantillon, mg/ml.

Note

1. Si la valeur OD est supérieure à 1.0, l'échantillon doit être dilué correctement puis déterminé. Attention à multiplier le multiple de dilution dans la formule de calcul.
2. Le réactif a une certaine toxicité. Veuillez prendre des mesures de protection pendant le fonctionnement pour éviter l'inhalation ou le contact avec la peau.
3. Lors du calcul en fonction de la concentration en protéines de l'échantillon, la protéine présente dans l'échantillon lui-même doit être extraite séparément et déterminée.

Exemples expérimentaux

• 0.2g de patte de souris est prélevé pour le traitement des échantillons, et le surnageant est retiré et utilisé selon les étapes de détermination. ΔA =AT-AB = 0.177-0.06 = 0.117 est mesuré par 96 bien plaque, et la courbe standard y = 0,0383x + 0.022 est amené, et x = 2.48 est

La teneur en hydroxyproline dans les tissus (µg/g masse) = 4x ​​÷ W = 4 × 2.48 ÷ 0.2 = 49.6 µg/g masse.

Citations de produits récentes

• Éventail Litong,Jiaqing Chen,Yanmeng Tao,et autres. Amélioration de la différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses et réparation du cartilage par la ghréline. Journal de recherche orthopédique. Janvier 2019;(IF3.043)

Produits connexes

BC1550/BC1555 Transaminase glutamo-pyruvique (Google Tag) Kit d'analyse d'activité BC1560/BC1565 Transaminase glutamique-oxalacétique (A OBTENU) Kit de test d'activité BC0290/BC0295 Proline (PRO) Kit d'analyse de contenu

Acide aminé BC1570/BC1575 (AA) Kit d'analyse du contenu BC0180/BC0185 Cystéine (Cys) Kit d'analyse de contenu BC1580/BC1585 Acide glutamique (Glu) Kit d'analyse de contenu

Spécifications techniques:

Limite de détection: 0.057 µg/mL

Plage linéaire: 0.117-30 µg/mL