Kit de test d'activité Solarbio Ca++Mg++-ATPase

Californie++Mg++-Kit de test d'activité ATPase

Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.

Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre

Chat non: BC0960

Taille: 50T/24S

Composants:

Réactif I: Liquide 30 mL×1. Stockage à 4℃.

Réactif II: Liquide 4 mL×1. Stockage à 4℃.

Réactif III: Poudre × 2. Stockage à -20℃. Dissoudre soigneusement avec 1 mL d'eau distillée avant utilisation. Le réactif reste peut être conservé à -20 ℃ pour une semaine.

Réactif IV: Liquide 2 mL×1. Stockage à 4℃.

Réactif V: Poudre × 1. Stockage à 4℃. Dissoudre soigneusement avec 3 mL d'eau distillée avant utilisation. Réactif VI: Poudre × 1. Stockage à 4℃. Dissoudre soigneusement avec 15 mL d'eau distillée avant utilisation, peut être conservé à 4 ℃ pour une semaine.

Réactif vivant: Poudre × 1. Stockage à 4℃. Dissoudre soigneusement avec 15 mL d'eau distillée avant utilisation, peut être conservé à 4 ℃ pour une semaine.

Réactif VIII: Liquide 15 mL×1. Stockage à RT.

Solution standard: Liquide 1 mL×1. 10 μmol / ml de phosphore standard liquide, stockage à 4℃.

0.5 μmol / ml de solution de travail de phosphore standard: Diluer le 10 μmol / ml Standard 20 fois avec de l'eau distillée à 0.5 μmol / ml Standard. Par exemple: ajouter 1.9 mL d'eau distillée pour 0.1 ML de standard, bien mélanger.

Réactif de fixation du phosphore:

Préparer les réactifs pour déterminer le contenu du phosphore: faire une solution comme rapport de volume de H2O: Réactif VI: Réactif vivant: Réactif VIII = 2:1:1:1, qui devrait être jaune clair. Il montre une perte d'efficacité si la couleur est modifiée, Pollution du phosphore si la couleur est passée en bleu. Préparez le réactif lorsqu'il sera utilisé.

Note: Il vaut mieux utiliser de nouveaux béchers, Tiges en verre et pipettes en verre ou articles en plastique jetables lors de la réactif pour éviter la pollution du phosphore.

Description du produit:

Ca ++ Mg ++ - L'ATPase est largement distribuée dans les plantes, animaux, micro-organismes et cellules, qui catalyse l'hydrolyse de l'ATP pour former l'ADP et le phosphore inorganique.

Ca ++ Mg ++ - L'ATPase décompose l'ATP pour produire de l'ADP et du phosphore inorganique. L'activité de l'ATPase peut être détectée en mesurant la quantité de phosphore inorganique.

Réactifs et équipements requis mais non fournis:

Spectrophotomètre, centrifugeuse de bureau, pipette réglable, bain d'eau, 1 Cuvette en verre ml, mortier/homogénéisateur, glace et eau distillée.

 

Procédure:

je. La préparation des échantillons:

1. Bactéries ou cellules:

Collectionner des bactéries ou des cellules dans un tube à centrifugeuse, centrifugation, et jeter le surnageant. Suggérer d'ajouter 1 ml de réactif i à 5 millions de bactéries ou de cellules. Utilisez des ultrasons pour diviser les bactéries et les cellules (placé sur la glace, puissance ultrasonique 20%, temps de travail 3 secondes, intervalle 10 secondes, répéter pour 30 fois). Centrifuger à 8000 ×g pour 10 Minutes à 4 ℃ et prenez le surnageant sur la glace avant de tester.

2. Tissu:

Ajouter 1 ml de réactif i dans 0.1 g de tissu, broyer complètement sur la glace. Centrifuger à 8000 ×g pour 10 Minutes à 4 ℃ et prenez le surnageant sur la glace avant de tester.

3. Sérum: Directement

II. Détermination:

1. Spectrophotomètre de préchauffage pour 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 660 nm, Réglez le comptoir à zéro avec de l'eau distillée.
2. Ajouter les réactifs suivants au tube EP:

Réactif (µL)	Tube de commande (C)	Tube à essai (T)
Réactif I	130	90
Réactif II	80	80
Réactif III	40	40
Réactif IV		40
Échantillon		200
Bien mélanger, Placez ensuite la solution de réaction dans un 37 ℃ (mammifère) ou 25 ℃ (autres espèces) bain-marie pour 10 minutes.
Réactif V	50	50
Échantillon	200
Bien mélanger, centrifuger à 4000 ×g pour 10 minutes à température ambiante, prends le surnageant.

3. Détermination du contenu du phosphore, Ajouter les réactifs suivants à 1.5 tube ML EP:

Réactif (µL)	Tube vierge (B)	Tube standard (S)	Tube de commande (C)	Tube à essai (T)
0.5 μmol / ml de phosphore standard liquide		100
Surnageant			100	100
Eau distillée	100
Réactifs pour déterminer le contenu du phosphore	1000	1000	1000	1000

Bien mélanger, Placez ensuite la solution de mélange dans un bain d'eau de 40 ℃ pour 10 minutes. Refroidissement à température ambiante et détecter l'absorbance à 660 nm. Le tube vide et le tube standard ont juste besoin d'un ou deux tubes.

III. Calcul:

1. Sérum:

Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyse le décomposé de l'ATP pour produire 1 μmol de phosphore inorganique par heure chaque millilitre de sérum.

Ca ++ Mg ++ - ATPase (U/mL)= CS ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]× vrv ÷ s ÷ t

= 7,5 ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]

2. Tissu, bactéries, ou cellules

• Concentration en protéines:

Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyse le décomposé de l'ATP pour produire 1 μmol de phosphore inorganique par heure chaque milligramme de protéine tissulaire.

Ca ++ Mg ++ - ATPase (U/mg prot)= CS ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(Vs × Cpr)÷ t

= 7,5 ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]÷Cpr

• Poids de l'échantillon:

Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyse le décomposé de l'ATP pour produire 1 μmol de phosphore inorganique par heure, Chaque milligramme de tissu.

Ca ++ Mg ++ - ATPase (U/g poids)= CS ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(Vs ÷ v1 × w)÷ t

= 7,5 ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]÷W

• bactéries ou cellules

Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyse le décomposé de l'ATP pour produire 1 μmol de phosphore inorganique par heure 10000 cellules ou bactéries.

Ca ++ Mg ++ - ATPase (U/104cellule )= CS ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(Vs ÷ v1 × 500)÷ t

= 0,015 ×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]

Cs: Concentré de tube standard, 0.5 µmol/mL;

Corde: Volume total de réaction, 0.5 ml; Contre: Volume d'échantillon, 0.2 ml;

Cpr: Concentration de protéines de l'échantillon (mg/ml); T: Temps de réaction (min), 1/6 heure;

W: Poids de l'échantillon (g);

VL: Volume de réactif I, 1 ml;

500: La quantité de bactéries ou de cellules, 5 million.

Note

1. Ce kit peut détecter 24 Tubes d'échantillons Ca ++ Mg ++ -ATPase dans 50 Les tubes pour chaque échantillon ont besoin d'un tube comme contrôle.
2. Cette méthode a les caractéristiques de la trace, sensible et rapide. Les tubes à essai utilisés pour la détermination sont strictement sans phosphate. Éviter la pollution du phosphore est la clé du succès de la détection.

Exemple expérimental:

1. Prendre du pancréas et ajouter 1 ML de réactif I pour l'homogénéisation du bain de glace. Après centrifugation à 4 ℃ pour 10 min, Le surnageant est mis sur la glace et exploité en fonction des étapes de détermination. Δat = 0,916-0,389 = 0,527, ΔAS = 0,398-0,004 = 0,394

Ca ++ Mg ++- Activité ATPase (U/g masse) = 7.5 × Δat ÷ Δas ÷ w = 100.32 U/g masse.

2. Prendre 0,1 g de saule et ajouter 1 ml de réactif ⅰ pour l'homogénéisation du bain de glace. Après centrifugation à 4 ℃ pour 10 min, Le surnageant est mis sur la glace et exploité en fonction des étapes de détermination. Le Δat = 0,137-0,124 = 0,013, et les ΔAS = 398-0,004 = 0,394

Californie + + Mg + + – Activité ATPase (U/g masse) = 7,5 × Δat ÷ Δas ÷ w = 2.47 U/g masse.

Les références

[1] Datiles m J, Johnson par un, McCarty R E. Inhibition de l'activité ATPase de la partie catalytique des ATP synthases par des amphiphiles cationiques[J.]. Biochimie et biophysique ACTA (BBA)-Bioénergétique, 2008, 1777(4): 362-368.

Produits connexes

BC0060 / BC0065 NA + K + - Kit de test d'activité ATPase

Kit de test d'activité ATP BC0300 / BC0305