Kit Uji Aktivitas Solarbio Ca++Mg++-ATPase

Ca++mg++-Kit Uji Aktivitas ATPase

Catatan: Ambil dua atau tiga sampel berbeda untuk prediksi sebelum pengujian.

Peralatan Operasi: Spektrofotometer

Kucing No: SM0960

Ukuran: 50T/24S

Komponen:

Reagen I: Cairan 30 mL×1. Penyimpanan pada suhu 4℃.

Reagen II: Cairan 4 mL×1. Penyimpanan pada suhu 4℃.

Reagen III: Bedak×2. Penyimpanan pada -20℃. Larutkan seluruhnya dengan 1 mL air suling sebelum digunakan. Reagen sisanya dapat disimpan pada suhu -20℃ selama satu minggu.

Reagen IV: Cairan 2 mL×1. Penyimpanan pada suhu 4℃.

Reagen V: Bedak×1. Penyimpanan pada suhu 4℃. Larutkan seluruhnya dengan 3 mL air suling sebelum digunakan. Reagen VI: Bedak×1. Penyimpanan pada suhu 4℃. Larutkan seluruhnya dengan 15 mL air suling sebelum digunakan, dapat disimpan pada suhu 4℃ selama satu minggu.

Reagen VII: Bedak×1. Penyimpanan pada suhu 4℃. Larutkan seluruhnya dengan 15 mL air suling sebelum digunakan, dapat disimpan pada suhu 4℃ selama satu minggu.

Reagen VIII: Cairan 15 mL×1. Penyimpanan di RT.

Solusi standar: Cairan 1 mL×1. 10 μmol/mL cairan fosfor standar, penyimpanan pada suhu 4℃.

0.5 larutan kerja fosfor standar μmol/mL: Encerkan 10 standar mol/mL 20 kali dengan air sulingan 0.5 standar mol/mL. Misalnya: menambahkan 1.9 mL air suling ke 0.1 mL standar, aduk rata.

Reagen pengikat fosfor:

Siapkan reagen untuk menentukan kandungan fosfor: jadikan larutan sebagai perbandingan volume H2O: Reagen VI: Reagen VII: Reagen VIII =2:1:1:1, yang seharusnya berwarna kuning muda. Ini menunjukkan kehilangan kemanjuran jika warnanya diubah, polusi fosfor jika warnanya berubah menjadi biru. Siapkan reagen saat akan digunakan.

Catatan: Sebaiknya gunakan gelas kimia yang baru, batang kaca dan pipet kaca atau peralatan plastik sekali pakai saat membuat reagen untuk menghindari pencemaran fosfor.

Deskripsi Produk:

Ca++Mg++-ATPase didistribusikan secara luas pada tumbuhan, binatang, mikroorganisme dan sel, yang mengkatalisis hidrolisis ATP untuk membentuk ADP dan fosfor anorganik.

Ca++Mg++-ATPase menguraikan ATP untuk menghasilkan ADP dan fosfor anorganik. Aktivitas ATPase dapat dideteksi dengan mengukur jumlah fosfor anorganik.

Reagen dan Peralatan Diperlukan tetapi Tidak Disediakan:

Spektrofotometer, mesin sentrifugal meja, pipet yang dapat disesuaikan, mandi air, 1 mL kuvet kaca, mortir/homogenizer, es dan air suling.

 

Prosedur:

SAYA. Persiapan sampel:

1. Bakteri atau sel:

Mengumpulkan bakteri atau sel ke dalam tabung centrifuge, sentrifugasi, dan buang supernatannya. Sarankan untuk menambahkan 1mL Reagen I ke dalam 5 juta bakteri atau sel. Gunakan ultrasonik untuk membelah bakteri dan sel (ditempatkan di atas es, kekuatan ultrasonik 20%, waktu kerja 3 detik, selang 10 detik, ulangi untuk 30 waktu). Sentrifugasi di 8000 ×g untuk 10 menit pada suhu 4℃ dan ambil supernatan di atas es sebelum pengujian.

2. Jaringan:

Menambahkan 1 mL Reagen I ke dalam 0.1 g tisu, sepenuhnya digiling di atas es. Sentrifugasi di 8000 ×g untuk 10 menit pada suhu 4℃ dan ambil supernatan di atas es sebelum pengujian.

3. Serum: Secara langsung

II. Tekad:

1. Panaskan spektrofotometer untuk 30 menit, sesuaikan panjang gelombangnya 660 nm, atur penghitung ke nol dengan air suling.
2. Tambahkan reagen berikut ke tabung EP:

Reagen (μL)	Tabung kontrol (C)	Tabung reaksi (T)
Reagen I	130	90
Reagen II	80	80
Reagen III	40	40
Reagen IV		40
Sampel		200
Aduk rata, kemudian tempatkan larutan reaksi dalam suhu 37℃ (mamalia) atau 25℃ (spesies lain) mandi air untuk 10 menit.
Reagen V	50	50
Sampel	200
Aduk rata, sentrifugasi di 4000 ×g untuk 10 menit pada suhu kamar, ambil supernatannya.

3. Penentuan kandungan fosfor, tambahkan reagen berikut ke dalam 1.5 mL tabung EP:

Reagen (μL)	Tabung kosong (B)	Tabung standar (S)	Tabung kontrol (C)	Tabung reaksi (T)
0.5 μmol/mL cairan fosfor standar		100
Supernatan			100	100
Air sulingan	100
Reagen untuk menentukan kandungan fosfor	1000	1000	1000	1000

Aduk rata, lalu masukkan larutan campuran ke dalam penangas air bersuhu 40℃ 10 menit. Dinginkan hingga suhu kamar dan deteksi serapannya pada 660 nm. Tabung kosong dan tabung standar hanya membutuhkan satu atau dua tabung.

AKU AKU AKU. Perhitungan:

1. Serum:

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis penguraian ATP untuk menghasilkan 1 μmol fosfor anorganik per jam setiap mililiter serum.

Ca++Mg++-ATPase (U/mL)=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv − s − T

=7,5×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]

2. Jaringan, bakteri, atau sel

• Konsentrasi protein:

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis penguraian ATP untuk menghasilkan 1 μmol fosfor anorganik per jam setiap miligram protein jaringan.

Ca++Mg++-ATPase (U/mg keuntungan)=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv ™(Vs×Cpr)−T

=7,5×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]−Cpr

• Berat sampel:

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis penguraian ATP untuk menghasilkan 1 μmol fosfor anorganik per jam, setiap miligram jaringan.

Ca++Mg++-ATPase (berat U/g)=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv ™(Vs.V1×W)−T

=7,5×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]−W

• bakteri atau sel

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis penguraian ATP untuk menghasilkan 1 μmol fosfor anorganik per jam setiap 10000 sel atau bakteri.

Ca++Mg++-ATPase (U/104sel )=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv ™(Vs.V1×500)−T

=0,015×[ΔA(T)-ΔA(C)]−[ΔA(S)-ΔA(B)]

Cs: Konsentrat tabung standar, 0.5 mol/mL;

Tali: Volume reaksi total, 0.5 ml; Vs: Volume sampel, 0.2 ml;

Cpr: Konsentrasi protein sampel (mg/mL); T: Waktu reaksi (menit), 1/6 jam;

W: Berat sampel (G);

Vl: Volume reagen I, 1 ml;

500: Jumlah bakteri atau sel, 5 juta.

Catatan

1. Kit ini dapat mendeteksi 24 tabung sampel Ca++Mg++ -ATPase di 50 tabung untuk setiap sampel membutuhkan satu tabung sebagai kontrol.
2. Metode ini mempunyai ciri-ciri trace, sensitif dan cepat. Tabung reaksi yang digunakan untuk penentuan benar-benar bebas fosfat. Menghindari pencemaran fosfor adalah kunci keberhasilan pendeteksian.

Contoh eksperimental:

1. Ambil pankreas dan tambahkan 1 mL Reagen I untuk homogenisasi penangas es. Setelah sentrifugasi pada 4℃ selama 10 menit, supernatan diletakkan di atas es dan dioperasikan sesuai langkah penentuan. ΔAT = 0,916-0,389=0,527, ΔAS =0,398-0,004=0,394

Ca++Mg++- aktivitas ATPase (massa U/g) = 7.5 × ΔAT ÷ΔAS ÷ W = 100.32 massa U/g.

2. Ambil 0,1g pohon willow dan tambahkan 1 mL Reagen Ⅰ untuk homogenisasi penangas es. Setelah sentrifugasi pada 4℃ selama 10 menit, supernatan diletakkan di atas es dan dioperasikan sesuai langkah penentuan. ΔAT=0,137-0,124=0,013, dan ΔAS=398-0,004=0,394

Ca + + mg + + – aktivitas ATPase (massa U/g) = 7,5×ΔAT − ΔAS − W = 2.47 massa U/g.

Referensi

[1] Datales M J, Johnson E A, McCarty R E. Penghambatan aktivitas ATPase dari bagian katalitik sintase ATP oleh amfifil kationik[J]. Jurnal Biokimia dan Biofisika (BBA)-Bioenergi, 2008, 1777(4): 362-368.

Produk-produk terkait

BC0060/BC0065 Na+K+ — Kit Uji Aktivitas ATPase

Kit Uji Aktivitas ATP BC0300/BC0305