Kit d'extraction de microARN de tissus de petite quantité

1. Composants du kit de réactifs

Caractéristiques	50T	100T
Chat. Non.	SN0333	SN0334
Colonnes d'extraction d'ARN (ensemble)	50 (ensemble)	100 (ensemble)
Colonnes de nettoyage d'ADN (ensemble)	50 (ensemble)	100 (ensemble)
Extraction d'ARN Tampon II	30ml	2×30 ml
Tampon d'élimination des inhibiteurs	30ml	2×30 ml
Tampon de lavage 1	15 ml	2×15 ml
Tampon d'élution	20 ml	20 ml
Manuel d'instructions	1	1

 

2. Stockage

Ce kit de réactifs doit être conservé à température ambiante (15-25℃) à l'état sec et est stable pendant 12 mois.

3. Instructions d'utilisation du kit de réactifs

3.1 Ce kit est destiné à des fins de recherche en biologie moléculaire et ne doit pas être utilisé pour le diagnostic ou le traitement de maladies..

3.2 Certains composants du kit contiennent des irritants; il est conseillé de prendre les précautions nécessaires (comme porter des vêtements de protection et des lunettes).

3.3 L'utilisation de ce kit nécessite un équipement supplémentaire tel qu'une centrifugeuse à grande vitesse, bain d'eau (bain en métal), mélangeur de vortex, éthanol anhydre, l'azote liquide, chloroforme, eau déminéralisée stérile, et tubes EP.

4. Introduction au kit de réactifs

Ce kit de purification de microARN fournit une méthode rapide et efficace pour purifier les microARN de divers tissus, convient à la plupart des espèces. Tissus dépassant 100 mg peut être traité à l’aide de ce kit de purification d’ARN. Le kit utilise une technologie spéciale de colonne de nettoyage d'ADN pour éliminer l'ADN génomique et les gros fragments d'ARN pendant le processus expérimental.. En général, une digestion supplémentaire sur les colonnes d'ADN n'est pas nécessaire, prévenir la dégradation des microARN.

Le kit de purification rapide de l'ARN peut extraire le microARN végétal à l'intérieur 1 heure. Le microARN extrait peut être directement utilisé pour la RT-RAP, Transfert du Nord, etc.. L'ensemble du processus de purification ne nécessite pas de réactifs toxiques tels que le phénol-chloroforme, rendant le kit de purification de microARN adapté à divers autres échantillons.

5. Principes et procédures expérimentaux

6. Processus d'extraction

Précautions avant de commencer l'expérience:

UN. Avant utilisation, ajouter la quantité spécifiée d'éthanol anhydre à Laver Tampon 1 selon l'étiquette sur le flacon de réactif, et cochez l'étiquette pour indiquer l'ajout d'éthanol anhydre.

B. Le tampon d'élution est un 0.1x solution TE contenant une quantité minimale d'EDTA. Si l'EDTA a un impact sur les expériences ultérieures, il est recommandé d'utiliser de l'eau déionisée stérile au lieu du tampon d'élution.

1. Traitement des échantillons:

UN. Tissus végétaux ou animaux: Récupérez des mouchoirs frais autant que possible. Pour les tissus végétaux et animaux, broyer avec de l'azote liquide, puis ajoutez rapidement 500µl de tampon d’extraction d’ARN II. Retourner et bien mélanger, éviter les amas de tissus dans le lysat pour éviter la dégradation de l'ARN.

B. Tissus cellulaires: Recueillir des cellules fraîches en croissance dans un 1.5 tube à centrifuger ml, centrifuger à 13,000 tr/min pour 1 min, collecter des cellules, ajouter 500µl de tampon d’extraction d’ARN II, vortexer et bien agiter.

2. Incuber à56℃ pour 1-3 min. Si l'échantillon a une teneur élevée en polysaccharides, il est conseillé de sauter cette étape.

3. Vortex pour 30 seconde.

4. Centrifuger le lysat pour 10 mon ça 14,000 tr/min (20,000×g).

(Note: Les polysaccharides issus de matières végétales peuvent donner lieu à des substances collantes à cette étape, qui peut couper l'ADN dans les étapes suivantes. Supprimez ces substances au cours de cette étape. Après centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau Purification de l'ADN colonne.)

5. Ajouter le surnageant obtenu à la colonne de nettoyage de l'ADN (environ 650-700μl à chaque fois), centrifuger à plus 8,000 tr/min pour 1 min, récupérer le filtrat (Le microARN est dans le filtrat à ce stade).
6. Estimer le volume du filtrat avec précision, ajouter 0.5 fois le volume d'éthanol absolu. S'il y a une petite quantité de précipitations, cela n'affecte pas les expériences ultérieures. Ajouter le liquide à la colonne de purification d'ARN, centrifuger à 13,000 tr/min pour 1 min.
7. Jetez les déchets et placez la colonne de purification d’ARN dans un tube de collecte pour l’étape suivante.
8. Ajouter 600µl de tampon d’élimination des inhibiteurs, centrifuger à plus 8,000 tr/min pour 1 min, jeter les déchets, et remettez la colonne de purification d'ARN dans le tube de prélèvement pour l'étape suivante.
9. Ajouter 700µl de tampon de lavage 1 à la colonne de purification d'ARN, centrifuger à 14,000 tr/min (20,000×g) pour 2 min, prolonger le temps de centrifugation de manière appropriée pour garantir une membrane plus sèche.

(Note: Confirmez l’ajout d’éthanol absolu au tampon de lavage 1. La présence d'éthanol a un impact sévère sur les expériences ultérieures. Donc, la sécheresse de la membrane est cruciale. Après centrifugation, s'assurer de l'absence d'éthanol avant l'élution, jeter les déchets, et récupère le tube.

Après lavage avec Wash Buffer 1, la membrane de la colonne de purification d'ARN ne doit avoir qu'une légère couleur. Après centrifugation, retirer délicatement la colonne de purification d'ARN, en s'assurant qu'il ne touche pas le tube de prélèvement pour éviter les interférences de l'éthanol.)

10. Placez la colonne de purification d'ARN dans un nouveau tube à centrifuger, ajouter 100µl de tampon d'élution à la membrane, incuber à température ambiante pendant 5 min (15℃ à 25℃), centrifuger à plus 8,000 tr/min pour 1 min.

(Note: L'élution de l'ARN avec 50 µl de tampon d'élution peut augmenter la concentration en ARN mais diminuer le rendement total en ARN..)

11. Répétez l'étape précédente.

Note: Un nouveau tube à centrifuger peut être utilisé pour collecter l’ARN élué une deuxième fois, ou le tube de prélèvement d'origine peut être utilisé pour continuer à collecter l'ARN.