Nitrate réductase (NR) Kit d'analyse (méthode Griess-colorimétrique)

Présentation du produit

NR (CE 1.7.1.3) est une enzyme largement trouvée dans les plantes. Il joue un rôle crucial dans la conversion de l'azote nitrate en azote d'ammoniac et est également une enzyme inductible, affectant le rendement et la qualité des cultures. NR catalyse la réduction du nitrate en nitrite: No3- + NADH + H + → NO2- + Ils + + H2O. Dans des conditions acides, le NO 2 produit- peut participer à une réaction de diazotisation pour former un composé de couleur magenta. Ce composé a un pic d'absorption à 540 nm, et le changement d'absorbance à 540 NM peut être utilisé pour représenter l'activité enzymatique.

Composants du kit

• Solution mère d'inducteur: 50 ml x 1 bouteille
• Solution d'extraction: 30 ml x 1 bouteille
• Réactif: 12 ml x 1 bouteille
• Réactif deux: Poudre x 2 flacons
• Réactif trois: 15 ml x 1 bouteille
• Réactif quatre: 15 ml x 1 bouteille
• Standard: 1 ml x 1 ampoule

Préparation de la solution

1. Solution d'inducteur: Diluer la solution mère de l'inducteur 10 fois avec de l'eau distillée avant utilisation. Prendre 10 ml de solution mère d'inducteur et ajouter 90 mL d'eau distillée. Bien mélanger. Préparez frais avant chaque utilisation.
2. Réactif deux: Ajouter 1 mL d'eau distillée. Aliquote et stocker à -20 ° C. Il peut être stocké pendant 2 semaines à -20 ° C. Avant utilisation, diluer réactif deux 50 fois avec de l'eau distillée. Prendre 10 μl de réactif deux et ajouter 490 µL d'eau distillée. Bien mélanger.
3. Standard: Préparer un 0.1 μmol / ml de solution standard de nitrite de sodium en diluant le 10 μmol / ml Solution standard de nitrite de sodium 100 fois avec de l'eau distillée avant utilisation.

Remarques

1. Si l'absorbance est supérieure à 0.8, Diluer l'échantillon avec une solution d'extraction. Faites attention à l'ajustement du facteur de dilution en conséquence dans la formule de calcul.
2. Suivez strictement l'ordre d'ajouter des réactifs répertoriés dans le tableau des tests d'échantillon pour l'expérience.

Procédures expérimentales

je. Échantillon de traitement

1. Prétraitement des tissus:

   • Ajouter une quantité appropriée de solution d'inducteur à un bécher. Laver les échantillons frais, les sécher avec du papier filtre, et les placer dans la solution d'inducteur (Assez pour s'immerger). Incuber dans l'obscurité pour 2 heures. Supprimer les échantillons, les sécher avec du papier filtre, et geler à -20 ° C pour 30 minutes. Dégeler les échantillons et les sécher avec du papier filtre à nouveau. (Effectuer un traitement d'induction au besoin. En général, Le traitement d'induction n'est pas requis. Si les résultats pré-expérience ne montrent aucune activité, Un traitement d'induction est nécessaire.)
   • Peser approximativement 0.1 g d'échantillon et ajouter 1 ml de solution d'extraction selon le rapport du poids tissulaire (g) pour extraction le volume de la solution (ml) de 1:5 à 10. Broyer dans un bain de glace, centrifuger à 8000 g, 4°C pour 10 minutes, et récupérer le surnageant. Gardez le surnageant sur la glace pour les tests.

2. Prétraitement des cellules ou des bactéries:

   • Cuellez des échantillons de cellules ou de bactéries dans un tube à centrifugeuse et jetez le surnageant. Ajouter 1 ml de solution d'extraction par 5 millions de cellules ou de bactéries. Soniate les bactéries ou les cellules (pouvoir 200 W, sonication 3 secondes, intervalle 10 secondes, répéter 30 fois). Centrifuger à 8000 g, 4°C pour 10 minutes, Collectez le surnageant et gardez-le sur la glace pour les tests.

II. Étapes de dosage

1. Préchauffer le spectrophotomètre visible pendant au moins 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 540 nm, et zéro avec de l'eau distillée.
2. Essai d'échantillon: