Glutatión Reducido Solarbio (GSH) Kit de ensayo de contenido

Glutatión reducido (GSH) Kit de ensayo de contenido

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: Lector de espectrofotómetro/microplato

Numero de catalogo: BC1175

Tamaño: 100T/96S

Componentes:

reactivo yo: 100 mL×1. Almacenar a 4 ℃.

Reactivo II: 20 mL×1. Almacenar a 4 ℃.

Reactivo III: 8 mL×1. Almacenar a 4 ℃, proteger de la luz.

Estándar: Polvo 10 mg×1. Almacenar a 4 ℃, proteger de la luz.

Descripción del Producto

El glutatión es un tripéptido natural compuesto de ácido glutámico (Glu), cisteína (Cys) y glicina (Conquistar). Es un tipo de compuesto que contiene grupo de sulfhidryl (-Mierda), que existe ampliamente en el tejido animal, tejido vegetal, microorganismo, y levadura. El glutatión puede reaccionar con 5,5′-ditiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) producir ácido 2-nitro-5-mercaptobenzoico y disulfuro de glutatión (GSSG). 2-El ácido nitro-5-mercaptobenzoico es un producto amarillo, con la absorción máxima en 412 Nuevo Méjico.

Especificaciones técnicas

Límite mínimo de detección：3.763 µg/mL

Rango lineal：12.5-400 µg/mL

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados

Balance analítico, mortero/homogeneizador, centrífuga de baja temperatura, baño de agua, pipeta ajustable, lector de espectrofotómetro/microplato, Micro cubeta de vidrio o 96 bien plano plano y agua destilada.

Procedimiento

I. preparación de la muestra

1. Muestra de tejido

Lave los pañuelos frescos con PBS dos veces., Luego añade 0.1 G de tejido animal/vegetal en homogeneizador (El homogeneizador se ha enjuagado con el Reactivo I y se ha colocado en hielo antes de su uso.). Agregar 1 mL de Reactivo I (La proporción de tejido y reactivos puede mantenerse constante), moliendo completamente sobre hielo (Usar nitrógeno líquido tendrá un mejor efecto de molienda.). Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (Si la prueba no se puede completar temporalmente, El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ para 10 días.)

2. Muestra de sangre

Plasma: La muestra se centrifuga a 600 ×g para 10 minutos a las 4 ℃. Absorber el plasma superior en otro tubo agregando el mismo reactivo de volumen i. Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃, Tome el sobrenadante y colóquelo en 4 ℃ para la prueba. (Si la prueba no se puede completar temporalmente, El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ para 10 días.)

Globulo: La muestra se centrifuga a 600 ×g para 10 minutos a las 4 ℃. Descartando el plasma superior, Lave con tres veces el volumen de PBS para 3 veces (volver a sospechar del glóbulo con PBS, centrifugar en 600 ×g para 10 minutos), añadir un volumen igual de reactivo I. Después de mezclar, se coloca a 4 ℃ para 10 minutos. Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (Si la prueba no se puede completar temporalmente, El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ para 10 días.)

3. Celúla muestra

La cosecha de células no debe menos de 106, luego lávela con PBS por dos veces (volver a sospechar de la célula con PBS, centrifugar en 600 ×g para 10 minutos). El volumen de reactivo que agregué es tres veces el volumen de precipitación celular para volver a suspender las células. Congelación y descongelación repetidas 2 o 3 veces (Se sugiere que se congele en nitrógeno líquido, disuelto en baño de agua a 37 ℃). Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (Si la prueba no se puede completar temporalmente, El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ para 10 días.)

II. Procedimiento

1. Precaliente el espectrofotómetro/lector de microplacas para 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 412 Nuevo Méjico, poner a cero con destilado
2. Precaliente el reactivo II en 37 ℃ (célula de mamífero) o 25 ℃ (otras especies) baño de agua para 30
3. Determinación del tubo en blanco: Toma micro cubeta de vidrio, agregar 20 µL de agua destilada, 140 µL de Reactivo II, 40 μl de reactivo III a su vez, mezclar bien, lugar para 2 minutos, y medir 412 Nm absorbancia ab.
4. Hacer una curva estándar

Pesar 1 mg de estándar y disolverlo con 1 ml de agua destilada para obtener la concentración de 1 mg/mL. Tome la solución adecuada para preparar los estándares con la concentración de 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL, 25 μg/ml y 12.5 µg/mL (Reactivo diluido I diez veces antes de diluir la solución estándar).

Tomar un 1.5 ML Tube EP y agregar 20 μL de estándar, 140 μl de reactivo II y 40 μl de reactivo III a su vez. Después de que cada tubo se mezcle uniformemente, se le permite defender 2 minutos. Mida la absorbancia en 412 Nuevo Méjico, y absorbancia menos AB como abscisa. Hacer la curva estándar de acuerdo con la absorbancia (X) y concentración (y, µg/mL).

5. Prueba de tubo de muestra: Toma micro cubeta de vidrio, agregar 20 μl de muestra, 140 µL de Reactivo II, 40 μl de reactivo III a su vez, mezclar bien, y luego defender 2 minutos para probar la absorbancia atat 412 Nuevo Méjico, ΔA = AT – AB.
6. El funcionamiento del lector de microplacas es el mismo que el del espectrofotómetro, y la operación es tan rápida como

III. Cálculos

Según la curva estándar, Tome la muestra ΔA en la fórmula(X), y calcule la concentración de muestra y (µg/mL).

• Concentración de proteínas

GSH (μg/mg prot)= Y × VRV ÷ VRV ÷ CPR = Y ÷ CPR

• Peso de la muestra

GSH (μg/g)= Y × VRV ÷(VRV ÷ VSV × W)= y÷W

• cantidad de celda

GSH (μg/104 células)= Y × VRV ÷(VRV ÷ VSV × N)= y÷N

• Volumen de solución GSH (µg/mL)= 2y

norte: cantidad de celda, 106;

VSV: Volumen total de sobrenadante, 1 mililitros；

la cuerda: Volumen de sobrenadante agregado al sistema de reacción, 20 µL=0,02 ml； W.: Peso de la muestra, gramo;

RCP: Concentración de proteína sobrenadante, mg/mL.

2: El volumen de plasma (glóbulos) se diluye por una vez.

Nota:

1. La muestra debe homogeneizarse por completo.. Si la prueba no se puede completar temporalmente, se puede almacenar a-80 ℃.
2. Estándar: El glutatión reducido se prepara cuando la solución será
3. Si el contenido de GSH en la muestra es incierto, Diluir la muestra para varios gradientes antes
4. Porque el reactivo contengo precipitante de proteínas, El sobrenadante no se puede usar para la determinación de la concentración de proteínas. Si es necesario determinar el contenido de proteínas, tomar otro pañuelo.

Referencia:

• Alpert A J, Gilbert H.F.. Detección de glutatión oxidado y reducido con una reacción postcolumna de reciclaje.[j]. Bioquímica analítica, 1985, 144(2):553-562.
• Owens CW I, Belcher R V. Un micro método colorimétrico para la determinación de la glutatión[j]. Revista bioquímica, 1965, 94(3):

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