Pequeñas cantidades de ADN del nuevo kit de extracción de genomas de plantas

1. Componentes del kit de reactivos

Especificaciones	50t	100t
Gato. No.	SN0205	SN0206
Columnas de extracción de ADN (colocar)	50 (colocar)	100 (colocar)
Tampón reactivo I	20 ml	2×20 ml
Tampón reactivo II	15 ml	15 ml
Tampón reactivo C	30 ml	2 × 30 ml
Tampón de elución 1	15 ml	2 × 15 ml
Tampón de lavado	20 ml	20 ml
ARNasa A	1ml	1ml
Manual de instrucciones	1	1

2. Almacenamiento

Este kit debe almacenarse a temperatura ambiente. (15-25℃) en condiciones secas y se puede almacenar durante 12 meses. Las columnas de purificación y extracción de ADN se pueden almacenar en un ambiente fresco y seco durante hasta 1 año. La ARNasa A contiene un conservante y puede transportarse a temperatura ambiente., pero para almacenamiento a largo plazo, debe mantenerse a -20 ℃.

 

3. Instrucciones para usar el kit de reactivos

3.1 Este kit está destinado a fines de investigación de biología molecular y no debe utilizarse para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades..

3.2 Algunos componentes del kit contienen irritantes.; es recomendable tomar las precauciones necesarias (como usar ropa y gafas protectoras).

3.3 El uso de este kit requiere equipo adicional como una centrífuga de alta velocidad., baño de agua (baño de metal), mezclador Vortex, etanol anhidro, nitrógeno líquido, cloroformo, agua desionizada estéril, y tubos EP.

4. Introducción al kit de reactivos

El nuevo genoma vegetal purificación de ADN El kit proporciona un método rápido para la purificación del ADN.. Precipita eficazmente el ADN con tampones reactivos específicos II y C, recolección de ADN de alta pureza a través de columnas de adsorción.

Este kit es ampliamente aplicable para aislar muestras de tejidos vegetales y hongos., permitiendo la extracción de ADN total de plantas y hongos dentro 30 minutos. El proceso de extracción no implica reactivos tóxicos como el fenol-cloroformo.. El ADN extraído se puede utilizar directamente para experimentos posteriores, como PCR y transferencia Southern.

5. Principios y procedimientos experimentales：

6. Proceso de extracción

Precauciones antes de comenzar el experimento.:

A. Tampón reactivo I y tampón reactivo C tienden a precipitar a bajas temperaturas. Se recomienda calentarlos a 65°C durante 5 minutos hasta que los precipitados se disuelvan antes del uso normal.

B. Antes de usar Tampón de lavado 1, agregue la cantidad especificada de etanol absoluto como se indica en la etiqueta de la botella de reactivo y marque una marca de verificación (√) en la etiqueta para indicar la adición de etanol absoluto.

C. El tampón de elución es un 0.1x solución TE que contiene una cantidad mínima de EDTA. Si el EDTA afecta a experimentos posteriores, Se recomienda sustituir el tampón de elución por agua desionizada estéril..

1. Procesamiento de muestras:

A. Recolección y almacenamiento de materiales

Si los materiales recién recolectados no se pueden utilizar inmediatamente, colóquelos en nitrógeno líquido para enfriar y finalmente guárdelos a -80°C. Los materiales secos se pueden almacenar a temperatura ambiente..

B. Si las condiciones lo permiten, recoger materiales frescos siempre que sea posible, ya que los materiales frescos contienen menos polisacáridos y polifenoles.

C. Al recolectar hongos de cultivo líquido., separar el líquido y recoger las células fúngicas mediante centrifugación.

2. pesar alrededor 100 mg de muestras frescas o sin exceder 20 mg de material seco y molerlo con nitrógeno líquido.

(Nota: Las diferentes cantidades de muestra pueden variar; Es recomendable optimizar la cantidad de muestra mediante ensayos preexperimentales..)

3. Agregar 400µl de tampón reactivo I y 10 µl de ARNasaA (10 mg/ml), asegurándose de que no haya grumos en la muestra molida. Los grumos son difíciles de lisar., reduciendo el rendimiento del ADN. También, no mezclar Tampón reactivo I y ARNasaA antes del uso.

4. Incubar a 65°C durante 5 minutos, invertir suavemente la mezcla 2-3 veces. Este paso se utiliza para la lisis celular.. Si las muestras son difíciles de lisar, extender el tiempo de incubación, pero no más allá 30 minutos.

5. Agregar 130µl de tampón reactivo II y mezclar bien, luego bañarse en hielo durante 5 minutos (Este paso se utiliza para precipitar polisacáridos y proteínas.).

6. Centrifugar el lisado para 5 minutos a las 14,000 rpm (20,000×g).

(Nota: Algunos materiales vegetales pueden contener muchas sustancias viscosas en este paso., que puede cortar el ADN en los pasos siguientes. Por lo tanto, el estado ideal es eliminar estas sustancias durante este paso. Después de la centrifugación, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Si hay una cantidad significativa de material floculante en el sobrenadante después de la centrifugación, indica que la cantidad de muestra inicial era demasiado grande. Considere reducir la cantidad de muestra inicial.)

7. Transfiera con cuidado el líquido obtenido a un nuevo tubo de centrífuga..

(Nota: Se pueden transferir aproximadamente 450 μl de líquido.; para algunas especies, puede ser menos de 450μl.)

8. Agregue un volumen igual de Tampón reactivo C y un volumen igual de etanol absoluto al lisado y mezclar bien.

(Por ejemplo: Agregue 450 μl de tampón reactivo C, luego agregue 450μl de etanol absoluto. Si el volumen del lisado es inferior a 450μl, reducir proporcionalmente la cantidad de tampón reactivo C. La adición de tampón reactivo C provocará una ligera precipitación., pero no afectará los experimentos posteriores..)

9. Añadir el líquido obtenido a la columna de purificación de extracción de ADN. (equipo) (Aproximadamente 650-700 μl cada vez), centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos recogidos, y vuelva a insertar el tubo de recolección en la columna de purificación para el siguiente paso.

10. Repita el paso 9, agregue el líquido restante a la columna de purificación de extracción de ADN (equipo), centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos y el tubo de recogida.

11. Coloque la columna de purificación de extracción de ADN. (equipo) en el tubo de recolección, agregar 300μl de tampón de lavado 1,centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos, y colocar la columna de purificación de extracción de ADN. (equipo) De vuelta al tubo para el siguiente paso.

(Nota: Confirmar la adición de etanol absoluto en Wash Buffer 1.)

12. Agregar 500μl de tampón de lavado 1 a la columna de purificación de extracción de ADN (equipo), centrifugar en 14,000 rpm (20,000×g) para 2 minutos, extender el tiempo de centrifugación adecuadamente para garantizar que la membrana esté adecuadamente seca.

13. Coloque la columna de purificación de extracción de ADN. (equipo) en un nuevo tubo de centrífuga, déjalo descubierto, e incubar a 65°C durante 2 minutos. Amplíe este paso según sea necesario para evaporar el etanol y evitar que los residuos de etanol afecten a los experimentos posteriores..

14. Pipeta 100μl de tampón de elución sobre la membrana de la columna, centrifugar en 12,000 rpm para 2 minutos.

(Nota: 1. El uso de 50 μl de tampón de elución para eluir el ADN puede aumentar la concentración de ADN pero reducir el rendimiento general de ADN.; 2. El eluato que contiene ADN se puede volver a aplicar a la columna de purificación de extracción de ADN y centrifugar a 12,000 rpm para 2 minutos nuevamente para aumentar el rendimiento del ADN.)