Kit de detección de ácidos nucleicos de Salmonella

Artículo No：AP2308004 Especificación：24t/48t Almacenamiento：-20℃

Introducción del producto：

La salmonella es una bacteria patógena común transmitida por los alimentos que puede provocar salmonelosis., con huevos, aves de corral, y la carne son fuentes comunes de transmisión. Este kit de prueba utiliza fluorescencia cuantitativa en tiempo real. PCR Tecnología para amplificar selectivamente segmentos de ADN específicos de Salmonella en muestras como agua., heces, y alimentos sospechosos de estar contaminados. La presencia de Salmonella en la muestra se puede determinar mediante el valor Ct, o el nivel de contaminación de Salmonella en la muestra se puede determinar mediante una curva estándar.

Contenido del producto：

Componentes reactivos	AP2308004-01 (24T)	AP2308004-02 (48T)
Solución de premezcla de sal	11.5µL/pocillo× 8 pocillos/tira× 3 tiras	11.5µL/pocillo× 8 pocillos/tira× 6 tiras
Solución de reacción de sal	290µL	575µL
Sal Control positivo	100µL	100µL
Control negativo	100µL	100µL

Condiciones de almacenaje：

Almacenar a -20 ℃, la vida útil es al menos 12 meses.

Operación experimental：

1. Preparación de la muestra (Área de preparación de muestras)

1.1 Requisitos de muestra:

– Hisopos orales y cloacales: Tome un hisopo de algodón esterilizado., insértelo en la garganta o cloaca del pájaro, girar tres veces, colóquelo en un tubo de centrífuga, cortar la parte expuesta, cerrar bien la tapa, y etiquetarlo. Las muestras que puedan analizarse rápidamente deben almacenarse entre 2 y 8 °C dentro de un plazo 24 horas, y las muestras que no puedan analizarse rápidamente deben almacenarse a -20°C.

– Sangre pura: Utilice EDTA como anticoagulante., evitar el anticoagulante heparina, usar sangre entera fresca, o almacenar a 2-8°C por no más de 7 días, o almacenar a -20°C por no más de 3 meses, evitando ciclos repetidos de congelación y descongelación.

– Tejido: Tome tejido muscular o de órganos fresco que no exceda los 100 mg., Utilice 200-500 μl de agua estéril para preparar el homogeneizado de tejido., y continuar con la preparación posterior de la muestra.

1.2 Preparación de la muestra:

Según el “ES 4789.4-2016 Norma Nacional de Seguridad Alimentaria – Examen microbiológico de alimentos – Prueba de Salmonella” sección 5.1 u otras normas aplicables, procesar la muestra mediante preenriquecimiento, y preparar la suspensión bacteriana para su uso posterior.. Pesar 25g (mililitros) de la muestra y colocarla en un vaso de homogeneización estéril que contenga 225 ml de agua de peptona tamponada. (BPW). Homogeneizar a 8000 rpm/min a 10000 rpm/min durante 1 min a 2 min o colocarlo en una bolsa de homogeneización estéril que contenga 225 ml de BPW y homogeneizar con un estómago durante 1 min a 2 min.. Si la muestra es liquida, La homogeneización no es necesaria.; sacúdelo bien. Si se requiere medición de pH, ajuste el pH a 6,8 ± 0,2 usando 1 mol/ml de NaOH o HCl estéril. Realice operaciones asépticas para transferir la muestra a un matraz cónico de 500 ml.. Si usa una bolsa de homogeneización, Se puede realizar cultivo directo.. Incubar a 36°C±1°C durante 8 h a 18 h. Si la muestra es un producto congelado, Descongelar a temperaturas inferiores a 45 °C durante no más de 15 minutos o entre 2 °C y 5 °C durante no más de 18 h. Consulte Sanshi Biological “ADN total/Kit de extracción de ARN Manual” (Catalogar: DP201) u otros kits/métodos de extracción de ácidos nucleicos que cumplan los requisitos pertinentes para la extracción de ácidos nucleicos de muestras procesadas. Coloque las muestras de ácido nucleico extraídas en una nevera y realice la detección lo antes posible.. Almacenar a 4°C por no más de 7 días o a -20°C durante no más de 6 meses.

2. Preparación del sistema de reacción (Área de reacción)

2.1 Saca cada componente del kit., descongelar completamente a temperatura ambiente, centrífuga para 10 segundos, y centrifugar el líquido dentro de la pared del tubo y la tapa del tubo hasta el fondo del tubo.. Prepare la solución de reacción de acuerdo con la cantidad de muestra. (n+2, donde n es el número de muestras, se recomienda configurar 1 control positivo y 1 control negativo para cada experimento). Método de preparación específico: Llevar (n+2) Tubos de reacción que contienen solución de premezcla de Sal., agregue 11,5 µl de solución de reacción de PiHV a cada tubo, use una pipeta para mezclar bien, 23µL por pocillo, y guardar en una hielera.

2.2 Luego agregue secuencialmente 2 μL de control negativo., ácido nucleico de muestra extraída, y Sal control positivo a la solución de reacción. Cerrar la tapa del tubo, grabar un disco, y el volumen total de cada reacción es 25μL. Mezclar bien, centrífuga para 10 segundos, y realizar experimentos de amplificación en el instrumento de PCR.

3. Amplificación por PCR (Área de Amplificación y Análisis de Productos)

Predesnaturalización a 95°C para 2 minutos; Desnaturalización a 95°C para 10 segundos, recocido y extensión a 60°C para 35 segundos, 40 ciclos. Recoge señales de fluorescencia a 60 °C.. Elija el canal de fluorescencia FAM (Utilice instrumentos de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, como la serie ABI., si necesario, póngase en contacto con el fabricante o agregue tinte corrector ROX; de lo contrario, seguir los procedimientos normales).

4. Interpretación de resultados

4.1 Condiciones para la validez del experimento:

control positivo: Valor Ct en el canal FAM < 28 y la aparición de un “S”-curva de amplificación en forma. Control negativo: Sin valor Ct o valor Ct ≥ 40 y no “S”-curva de amplificación en forma. Los resultados del experimento son válidos en estas condiciones.; de lo contrario, repetir el experimento. Si la prueba repetida aún no es válida, póngase en contacto con el personal técnico del fabricante..

4.2 Interpretación de los resultados de las muestras:

Valor CT ≤ 35 con un “S”-La curva de amplificación con forma se considera positiva para el ácido nucleico de Salmonella.. Valor Ct entre 35 y 40 se considera sospechoso, y se recomienda volver a realizar la prueba. Esto puede deberse a una extracción de ácido nucleico deficiente o a la presencia de sustancias inhibidoras potentes. (como desinfectantes residuales, anticoagulantes, etc.). Se sugiere reprocesar la muestra para extracción y amplificación de ácidos nucleicos.. Primero, excluir “falso positivo” resultados causados ​​por la contaminación por aerosoles, luego vuelva a extraer y probar el ácido nucleico. Si, después de excluir la contaminación por aerosoles, la nueva prueba del canal FAM muestra un valor Ct < 35 con una curva de amplificación clara, se considera positivo; de lo contrario, se considera negativo.

Sin valor Ct o valor Ct ≥ 40 y no “S”-La curva de amplificación con forma se considera negativa para el ácido nucleico de Salmonella..

Precauciones：

• Para prevenir la contaminación, el experimento debe estar estrictamente dividido, y se prefiere el aislamiento físico entre particiones para evitar la contaminación cruzada debido a factores humanos. Use batas de laboratorio y guantes de látex durante el experimento., utilizar herramientas de forma independiente en diferentes áreas, cambiarse guantes y batas de laboratorio cuando sea necesario. Después de la PCR, no abra la tapa inmediatamente; Ábralo después de enfriarlo lo suficiente para minimizar la contaminación por aerosoles..
• Descongelar completamente los reactivos antes de su uso., pero evite ciclos repetidos de congelación y descongelación.. Los tubos de reacción de PCR incluidos en el kit son de 0,2 ml.; si es necesario un reemplazo, transferir después de la descongelación completa. Siga estrictamente las instrucciones para la preparación de reactivos y la adición de muestras.. Estaciones de trabajo, centrífugas, pipetas, y otros instrumentos deben desinfectarse periódicamente con desinfectantes que contengan cloro, alcohol, agentes de descontaminación de ácidos nucleicos, o luz ultravioleta.
• Un resultado negativo no significa necesariamente que el huésped no esté infectado con el virus.. Mala calidad de la muestra, baja carga de virus, o la presencia de sustancias inhibidoras fuertes (como el alcohol, desinfectantes, anticoagulantes, etc.) puede resultar en una extracción fallida de ácido nucleico (detección) y un “negativo” resultado. Seguir los criterios de interpretación de resultados., y cuando hay resultados sospechosos, primero excluir la contaminación por aerosoles. Si hay otras preguntas, contactar con el personal técnico del fabricante.
• Este producto es para un solo uso.. Los componentes del reactivo son sensibles a la luz natural.; Evite la exposición a la luz durante el embalaje y almacenamiento.. Después del embalaje, no congelar y descongelar repetidamente. Sólo para uso en investigación científica.; no para diagnóstico clínico u otros fines.