DNA電泳是一種通用實驗室技術，用於按大小分離DNA片段. 它允許研究人員可視化, 確認, 並根據其分子量純化DNA樣品.
了解這種技術背後的原理, 它的關鍵應用程序, 適當的使用對於在分子生物學中進行DNA分析的任何人至關重要, 法醫, 臨床診斷, 和更多. 本指南將提供DNA電泳的全面概述.
DNA電泳背後的原理是什麼?
通過電泳將DNA片段的分離是基於在電場的影響下通過瓊脂糖凝膠基質的負電荷DNA分子的遷移.
關鍵原則是:
- DNA分子由於其磷酸主鏈而具有均勻的負電荷. 這意味著他們的充電比率是恆定的.
- 當施加電流時, 帶負電荷的DNA分子將被吸引到正電極.
- 瓊脂糖凝膠提供了一種篩分效果，可導致較小的DNA片段遷移速度比較大的遷移速度更快.
- 所以, 隨著時間的推移, DNA碎片被大小分開, 與較大的碎片相比，較小的碎片更接近正電極.
瓊脂糖凝膠如何起作用?
瓊脂糖凝膠由從海藻提取的瓊脂糖聚合物組成. 當瓊脂糖粉末溶解在緩衝液中並允許凝固, 它形成一個含有小毛孔的凝膠.
瓊脂糖凝膠的特徵包括:
- 瓊脂糖的濃度決定孔徑. 較高的百分比使毛孔較小.
- 較小的孔徑緩慢遷移，但可以更好地分離小型DNA片段. 較大的毛孔可以更快地遷移，但分辨率較低.
- 將凝膠浸入導電緩衝液中，該緩衝液在電泳過程中保持恆定pH. 常見的緩衝液是TAE和TBE.
- 添加了像溴化乙錠這樣的插入染料. 該染料在DNA鹼基之間插入並允許在紫外線下可視化DNA帶.
運行DNA電泳需要什麼?
這 基本設備 和瓊脂糖凝膠電泳的材料是:
- 瓊脂糖凝膠 –通常 0.5-2% 瓊脂糖濃度. 更高的百分比以更好地分離小碎片.
- 凝膠托盤和梳子– 用樣品井鑄造凝膠.
- 電泳罐– 容納凝膠和緩衝液. 包含電流的電極.
- 電源 –應用恆定電流, 通常為50-150V.
- 緩衝 – 通常是Tae或Tbe浸入凝膠. 電流.
- 加載染料– 在加載到井中之前，含有甘油和溴苯酚藍，以在DNA樣品中增加密度和顏色.
- DNA梯子– 包含已知大小的DNA片段的分子量標記物. 用於識別樣品帶尺寸.
- 染色染料 – 溴化乙錠或在紫外線下可視化DNA帶的替代品.
DNA電泳的關鍵步驟是什麼?
DNA電泳的關鍵步驟如下:
- 製作帶有所需孔徑的瓊脂糖凝膠，然後將其設置在凝膠托盤中.
- 在凝膠中添加染色染料.
- 將DNA梯子和帶有染料混合的樣品加入井中.
- 將凝膠浸入電泳緩衝液中.
- 連接電極並施加電流以運行凝膠.
- 一旦染料鋒遷移了適當的距離，關閉電流.
- 可視化紫外線下的DNA頻段並拍攝它們以進行分析.
- 比較帶大小與DNA梯子以確定片段長度.
- 如果需要.
DNA電泳的主要應用是什麼?
在研究中，DNA電泳有許多重要用途, 臨床診斷, 法醫, 和生物技術:
- 確認DNA提取的成功或 聚合酶鍊式反應 通過可視化DNA的存在和數量來放大.
- 檢查PCR後DNA片段的尺寸, 複製, 或限制消化.
- 比較取證中的身份測試的DNA輪廓.
- 檢測基因插入, 刪除, 或與遺傳疾病相關的突變.
- 分開和純化特定尺寸的DNA片段, 例如. 複製.
- 通過帶強度量化樣品之間DNA的相對量.
- 檢查是否有散佈或多個帶中的DNA降解或污染物.
- 準備DNA進行測序, 南部印跡, 或電泳遷移率分析.
運行DNA凝膠時有什麼關鍵因素?
以下是在運行DNA凝膠時應牢記的一些關鍵考慮因素:
- 選擇適合預期碎片大小的瓊脂糖濃度.
- 在至少一個車道中包括一個DNA梯子以允許帶尺寸識別.
- 加載井之前，將樣品與負載染料徹底混合.
- 避免使用過多的DNA過載樣品井.
- 以適當的電壓運行凝膠 - 更高的電壓會導致帶畸變.
- 一旦染料鋒遷移了足夠的距離，停止電泳.
- 用紫外線可視化DNA時佩戴保護.
- 在樂隊瀰漫過多之前，快速拍攝凝膠.
- 切除DNA頻段時, 每個片段在紫外線托盤上使用乾淨的手術刀.
結論
所以, DNA電泳是一種必不可少的技術，它使用帶電的DNA分子通過電流下瓊脂糖凝膠基質的遷移，以按大小分離片段. 關鍵應用包括可視化PCR產品, 分析基因組DNA, 和DNA片段的製備純化. 執行電泳時，必須仔細注意原理和技術細節以獲得最佳結果. 透過練習, DNA電泳成為許多分子生物學實驗室的可靠主力技術.
常見問題解答
為什麼電泳會按大小分離DNA?
儘管具有相同的充電密度, 瓊脂糖凝膠孔的篩分作用導致DNA摩擦與大小成正比 – 較小的碎片較少的阻力. 這導致基於尺寸的分離.
從DNA梯子估算片段大小的準確性?
與梯子的比較將提供帶大小的近似值, 通常在內部 10% 準確性. 更精確的尺寸需要專門的片段分析.
為什麼梯子與樣品相同的凝膠運行?
與樣品一起運行DNA梯子，您可以在特定凝膠中可視化遷移.
您可以直接從帶強度量化DNA量嗎?
雖然相對強度提供了估計, 準確的DNA定量需要專門的儀器，例如分光光度計或熒光計.
為什麼酥脆, 清晰的頻帶在DNA電泳中很重要?
尖銳的DNA帶錶示完整, 純DNA片段. 擴散帶或塗片建議降解的DNA或污染物（如剩餘的底漆或鹽）干擾.
電泳可以按順序分開DNA?
不, 瓊脂糖凝膠電泳僅按大小分開. 然而, 諸如DGGE之類的特殊技術也可以根據次要序列差異分開.
