DNA electrophoresis เป็นเทคนิคในห้องปฏิบัติการทั่วไปที่ใช้ในการแยกชิ้นส่วน DNA ตามขนาด. ช่วยให้นักวิจัยเห็นภาพ, แยกแยะ, และทำให้ตัวอย่าง DNA บริสุทธิ์ตามน้ำหนักโมเลกุล.
ทำความเข้าใจหลักการเบื้องหลังเทคนิคนี้, การใช้งานที่สำคัญ, และการใช้งานที่เหมาะสมถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับทุกคนที่ทำงานกับการวิเคราะห์ DNA ในอณูชีววิทยา, นิติเวช, การวินิจฉัยทางคลินิก, และอื่น ๆ. คู่มือนี้จะให้ภาพรวมที่ครอบคลุมของ DNA อิเล็กโทรโฟรีซิส.
หลักการเบื้องหลัง DNA Electrophoresis คืออะไร?
การแยกชิ้นส่วน DNA ด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสขึ้นอยู่กับการเคลื่อนย้ายของโมเลกุล DNA ที่มีประจุลบผ่านเมทริกซ์เจลอะกาโรสภายใต้อิทธิพลของสนามไฟฟ้า.
โดยมีหลักการสำคัญคือ:
- โมเลกุล DNA มีประจุลบสม่ำเสมอเนื่องจากแกนหลักฟอสเฟต. ซึ่งหมายความว่าอัตราส่วนประจุต่อมวลคงที่.
- เมื่อมีการจ่ายกระแสไฟฟ้า, โมเลกุล DNA ที่มีประจุลบจะถูกดึงดูดเข้าหาขั้วบวก.
- เจลอะกาโรสให้ผลการกรองที่ทำให้ชิ้นส่วน DNA ขนาดเล็กเคลื่อนย้ายได้เร็วกว่าชิ้นที่ใหญ่กว่า.
- ดังนั้น, เมื่อเวลาผ่านไป, ชิ้นส่วน DNA จะถูกแยกออกจากกันตามขนาด, โดยมีชิ้นส่วนขนาดเล็กใกล้กับขั้วบวกมากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับชิ้นส่วนที่ใหญ่กว่า.
เจลอะกาโรสทำงานอย่างไร?
เจลอะกาโรสประกอบด้วยโพลีเมอร์อะกาโรสที่สกัดจากสาหร่ายทะเล. เมื่อผงอะกาโรสละลายในบัฟเฟอร์และปล่อยให้เซ็ตตัว, มีลักษณะเป็นเจลที่มีรูขุมขนเล็ก.
คุณสมบัติของเจลอะกาโรสได้แก่:
- ความเข้มข้นของอะกาโรสจะเป็นตัวกำหนดขนาดรูขุมขน. เปอร์เซ็นต์ที่สูงขึ้นจะทำให้รูขุมขนเล็กลง.
- ขนาดรูพรุนที่เล็กลงจะชะลอการย้ายถิ่นแต่ทำให้สามารถแยกชิ้นส่วน DNA ขนาดเล็กได้ดีขึ้น. รูพรุนที่ใหญ่ขึ้นช่วยให้การโยกย้ายเร็วขึ้นแต่มีความละเอียดต่ำกว่า.
- เจลจะถูกจุ่มลงในบัฟเฟอร์ที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้าซึ่งจะรักษาค่า pH ให้คงที่ในระหว่างการอิเล็กโตรโฟรีซิส. บัฟเฟอร์ทั่วไปคือ TAE และ TBE.
- มีการเติมสีย้อมแบบอินเทอร์คาเลชั่น เช่น เอทิเดียมโบรไมด์. สีย้อมนี้จะแทรกระหว่างฐาน DNA และช่วยให้มองเห็นแถบ DNA ภายใต้แสง UV.
สิ่งที่จำเป็นในการรัน DNA Electrophoresis?
ที่ อุปกรณ์พื้นฐาน และวัสดุสำหรับ agarose gel electrophoresis ได้แก่:
- อะกาโรสเจล –โดยทั่วไป 0.5-2% ความเข้มข้นของอะกาโรส. เปอร์เซ็นต์ที่สูงขึ้นเพื่อการแยกชิ้นส่วนขนาดเล็กได้ดีขึ้น.
- ถาดเจลและหวี– เพื่อหล่อเจลด้วยบ่อตัวอย่าง.
- ถังอิเล็กโทรโฟเรซิส– บรรจุเจลและบัฟเฟอร์. มีอิเล็กโทรดสำหรับจ่ายกระแสไฟ.
- แหล่งจ่ายไฟ –ให้กระแสไฟฟ้าคงที่, โดยทั่วไปคือ 50-150V.
- กันชน – โดยทั่วไป TAE หรือ TBE จะแช่เจล. ดำเนินการในปัจจุบัน.
- กำลังโหลดสีย้อม– ประกอบด้วยกลีเซอรอลและโบรโมฟีนอลบลูเพื่อเพิ่มความหนาแน่นและสีให้กับตัวอย่าง DNA ก่อนที่จะบรรจุลงในหลุม.
- บันไดดีเอ็นเอ– เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลที่มีชิ้นส่วน DNA ในขนาดที่ทราบ. ใช้เพื่อระบุขนาดวงดนตรีตัวอย่าง.
- สีย้อม – Ethidium bromide หรือทางเลือกอื่นในการแสดงภาพแถบ DNA ภายใต้แสง UV.
ขั้นตอนสำคัญใน DNA Electrophoresis คืออะไร?
ขั้นตอนสำคัญใน DNA อิเล็กโตรโฟเรซิสมีดังนี้:
- ทำเจลอะกาโรสตามขนาดรูพรุนที่ต้องการแล้ววางลงในถาดเจล.
- เพิ่มสีย้อมลงในเจล.
- ใส่บันได DNA และตัวอย่างที่ผสมกับสีย้อมลงในบ่อ.
- จุ่มเจลลงในบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิสในถัง.
- ติดอิเล็กโทรดแล้วจ่ายกระแสไฟให้เจลทำงาน.
- ปิดกระแสเมื่อหน้าสีย้อมเคลื่อนตัวไปในระยะที่เหมาะสม.
- แสดงภาพแถบ DNA ภายใต้แสง UV และถ่ายภาพเพื่อการวิเคราะห์.
- เปรียบเทียบขนาดวงดนตรีกับบันได DNA เพื่อกำหนดความยาวของชิ้นส่วน.
- ตัดแถบ DNA จากเจลสำหรับการใช้งานขั้นปลายน้ำ หากจำเป็น.
การใช้งานหลักของ DNA Electrophoresis คืออะไร?
DNA electrophoresis มีประโยชน์หลายประการในการวิจัย, การวินิจฉัยทางคลินิก, นิติเวช, และเทคโนโลยีชีวภาพ:
- ยืนยันความสำเร็จในการสกัด DNA หรือ พีซีอาร์ ขยายโดยการแสดงภาพการมีอยู่และปริมาณของ DNA.
- ตรวจสอบขนาดของชิ้นส่วน DNA หลัง PCR, การโคลนนิ่ง, หรือสรุปข้อจำกัด.
- เปรียบเทียบโปรไฟล์ DNA สำหรับการทดสอบตัวตนในนิติเวช.
- ตรวจจับการแทรกของยีน, การลบ, หรือการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับความผิดปกติทางพันธุกรรม.
- แยกและชำระล้างชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดเฉพาะ, เช่น. สำหรับการโคลนนิ่ง.
- หาปริมาณปริมาณ DNA สัมพัทธ์ระหว่างตัวอย่างตามความเข้มของแถบ.
- ตรวจสอบการเสื่อมสลายของ DNA หรือการปนเปื้อนจากการแพร่กระจายหรือหลายแถบ.
- เตรียม DNA เพื่อการหาลำดับ, รอยเปื้อนภาคใต้, หรือการตรวจการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้า.
ข้อควรพิจารณาที่สำคัญบางประการเมื่อใช้ DNA Gels?
ต่อไปนี้คือข้อควรพิจารณาสำคัญบางประการที่ควรคำนึงถึงในขณะที่ใช้งาน DNA gel:
- เลือกความเข้มข้นของอะกาโรสที่เหมาะสมกับขนาดชิ้นส่วนที่คาดหวัง.
- รวมบันได DNA ไว้ในอย่างน้อยหนึ่งเลนเพื่อให้สามารถระบุขนาดวงดนตรีได้.
- ผสมตัวอย่างให้ละเอียดด้วยสีย้อมก่อนบรรจุหลุม.
- หลีกเลี่ยงการบรรจุหลุมตัวอย่างที่มี DNA มากเกินไป.
- ใช้งานเจลด้วยแรงดันไฟฟ้าที่เหมาะสม – แรงดันไฟฟ้าที่สูงขึ้นอาจทำให้แถบความถี่บิดเบี้ยวได้.
- หยุดอิเล็กโตรโฟรีซิสเมื่อด้านหน้าของสีย้อมเคลื่อนไปในระยะห่างที่เพียงพอ.
- สวมอุปกรณ์ป้องกันเมื่อสร้างภาพ DNA ด้วยแสง UV.
- ถ่ายภาพเจลอย่างรวดเร็วก่อนที่แถบจะกระจายมากเกินไป.
- เมื่อตัดแถบ DNA ออก, ใช้มีดผ่าตัดที่สะอาดบนถาด UV สำหรับแต่ละชิ้นส่วน.
บทสรุป
ดังนั้น, DNA electrophoresis เป็นเทคนิคสำคัญที่ใช้การย้ายโมเลกุล DNA ที่มีประจุผ่านเมทริกซ์เจลอะกาโรสภายใต้กระแสไฟฟ้าเพื่อแยกชิ้นส่วนตามขนาด. การใช้งานที่สำคัญ ได้แก่ การแสดงภาพผลิตภัณฑ์ PCR, การวิเคราะห์จีโนมดีเอ็นเอ, และการเตรียมการทำให้บริสุทธิ์ของชิ้นส่วน DNA. ต้องให้ความเอาใจใส่อย่างระมัดระวังต่อหลักการและรายละเอียดทางเทคนิคเมื่อดำเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด. ด้วยการฝึกฝน, DNA อิเล็กโทรโฟรีซิสกลายเป็นเทคนิคที่เชื่อถือได้สำหรับห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยาหลายแห่ง.
คำถามที่พบบ่อย
เหตุใดอิเล็กโตรโฟรีซิสจึงแยก DNA ตามขนาด?
แม้จะมีความหนาแน่นประจุเท่ากันก็ตาม, ผลการกรองของรูพรุนเจล agarose ทำให้เกิดการเสียดสีของ DNA ตามสัดส่วน – ชิ้นส่วนที่เล็กกว่าจะมีความต้านทานน้อยกว่า. ส่งผลให้เกิดการแยกตามขนาด.
การประมาณขนาดชิ้นส่วนจากบันได DNA มีความแม่นยำเพียงใด?
การเปรียบเทียบกับบันไดจะให้ขนาดสายโดยประมาณโดยประมาณ, มักจะอยู่ภายใน 10% ความแม่นยำ. การกำหนดขนาดที่แม่นยำยิ่งขึ้นต้องใช้การวิเคราะห์ชิ้นส่วนแบบพิเศษ.
เหตุใดบันไดจึงวิ่งบนเจลเดียวกันกับตัวอย่าง?
การใช้บันได DNA ควบคู่ไปกับตัวอย่างช่วยให้คุณเห็นภาพการโยกย้ายในเจลเฉพาะนั้น และอธิบายถึงการบิดเบือนของการโยกย้ายในวง.
คุณสามารถวัดปริมาณปริมาณ DNA โดยตรงจากความเข้มของแถบได้หรือไม่?
ในขณะที่ความเข้มสัมพัทธ์เป็นค่าประมาณ, การหาปริมาณ DNA ที่แม่นยำต้องใช้เครื่องมือพิเศษ เช่น สเปกโตรโฟโตมิเตอร์หรือฟลูออโรมิเตอร์.
ทำไมคม., แถบใสที่สำคัญใน DNA อิเล็กโตรโฟรีซิส?
แถบ DNA ที่คมชัดแสดงว่าไม่เสียหาย, ชิ้นส่วน DNA บริสุทธิ์. แถบกระจายหรือรอยเปื้อนบ่งบอกว่า DNA เสื่อมโทรมหรือมีสิ่งปนเปื้อน เช่น ไพรเมอร์หรือเกลือที่เหลือซึ่งรบกวน.
อิเล็กโตรโฟเรซิสสามารถแยก DNA ตามลำดับได้หรือไม่?
เลขที่, agarose gel electrophoresis แยกตามขนาดเท่านั้น. อย่างไรก็ตาม, เทคนิคพิเศษเช่น DGGE ยังสามารถแยกตามความแตกต่างลำดับเล็กน้อยได้.
