Solarbio Ca++Mg++-ATP酶活性測定試劑盒

鈣++鎂++-ATP酶活性測定試劑盒

筆記: 測試前取兩個或三個不同的樣本進行預測.

操作設備: 分光光度計

目錄號: BC0960

尺寸: 50T/24S

成分:

試劑一: 液體 30 毫升×1. 4℃保存.

試劑二: 液體 4 毫升×1. 4℃保存.

試劑三: 粉末×2. -20℃保存. 徹底溶解 1 使用前的毫升蒸餾水. 其餘試劑可在-20℃保存1週.

試劑四: 液體 2 毫升×1. 4℃保存.

試劑V: 粉末×1. 4℃保存. 徹底溶解 3 使用前的毫升蒸餾水. 試劑六: 粉末×1. 4℃保存. 徹底溶解 15 使用前的毫升蒸餾水, 4℃可保存1週.

試劑七: 粉末×1. 4℃保存. 徹底溶解 15 使用前的毫升蒸餾水, 4℃可保存1週.

試劑VIII: 液體 15 毫升×1. 室溫儲存.

標準溶液: 液體 1 毫升×1. 10 μmol/mL磷標準液, 4℃保存.

0.5 µmol/mL 磷標準工作液: 稀釋 10 μmol/mL 標準品 20 次用蒸餾水至 0.5 μmol/mL 標準品. 例如: 添加 1.9 mL 蒸餾水至 0.1 標準品毫升數, 充分混合.

磷固定劑:

製備測定磷含量的試劑: 配製溶液為H2O的體積比: 試劑六: 試劑七: 試劑VIII =2:1:1:1, 應該是淺黃色的. 如果顏色改變則表示失效, 如果顏色變成藍色則磷污染. 使用時準備試劑.

筆記: 最好使用新燒杯, 製作試劑時使用玻璃棒、玻璃吸管或一次性塑膠器皿，避免磷污染.

產品描述:

Ca++Mg++-ATP酶廣泛分佈於植物中, 動物, 微生物和細胞, 催化ATP水解形成ADP和無機磷.

Ca++Mg++-ATP酶分解ATP產生ADP和無機磷. 透過測定無機磷的量可以檢測ATP酶的活性.

需要但未提供的試劑和設備:

分光光度計, 桌上型離心機, 可調式移液器, 水浴, 1 毫升玻璃比色皿, 研缽/均質器, 冰和蒸餾水.

 

程式:

我. 樣品製備:

1. 細菌或細胞:

將細菌或細胞收集到離心管中, 離心, 並棄去上清液. 建議添加1mL試劑I 5 百萬個細菌或細胞. 利用超音波分裂細菌和細胞 (置於冰上, 超音波功率 20%, 工作時間 3 秒, 間隔 10 秒, 重複 30 次). 離心機在 8000 ×g 為 10 4℃分鐘，測試前在冰上取上清液.

2. 組織:

添加 1 mL 試劑 I 注入 0.1 克組織, 在冰上充分研磨. 離心機在 8000 ×g 為 10 4℃分鐘，測試前在冰上取上清液.

3. 血清: 直接地

二. 決心:

1. 預熱分光光度計 30 分分鐘, 調整波長至 660 奈米, 用蒸餾水將計數器設為零.
2. 將下列試劑加入EP管中:

試劑 (微升)	控制管 (C)	試管 (時間)
試劑一	130	90
試劑二	80	80
試劑三	40	40
試劑四		40
樣本		200
充分混合, 然後將反應液置於37℃ (哺乳動物) 或25℃ (其他物種) 水浴用於 10 分分鐘.
試劑V	50	50
樣本	200
充分混合, 離心機在 4000 ×g 為 10 室溫下分鐘, 取上清液.

3. 磷含量的測定, 將下列試劑添加至 1.5 mL EP 管:

試劑 (微升)	空白管 (乙)	標準管 (S)	控制管 (C)	試管 (時間)
0.5 μmol/mL磷標準液		100
上清液			100	100
蒸餾水	100
測定磷含量的試劑	1000	1000	1000	1000

充分混合, 然後將混合液置於40℃水浴中 10 分分鐘. 冷卻至室溫並檢測吸光度 660 奈米. 空白管和標準管只需要一根或兩根管.

三、. 計算:

1. 血清:

單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化ATP分解所產生的酵素量 1 每毫升血清每小時微摩爾無機磷.

Ca++Mg++-ATP酶 (單位/毫升)=銫×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]×Vrv÷s÷T

=7.5×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]

2. 組織, 細菌, 或者 細胞

• 蛋白質濃度:

單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化ATP分解所產生的酵素量 1 每毫克組織蛋白每小時微摩爾無機磷.

Ca++Mg++-ATP酶 (U/毫克蛋白質)=銫×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]×Vrv÷(Vs×Cpr)÷T

=7.5×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]÷心肺復甦

• 樣品重量:

單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化ATP分解所產生的酵素量 1 每小時微摩爾無機磷, 每毫克組織.

Ca++Mg++-ATP酶 (單位/克重量)=銫×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]×Vrv÷(Vs÷V1×W)÷T

=7.5×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]÷W

• 細菌或細胞

單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化ATP分解所產生的酵素量 1 每小時微摩爾無機磷 10000 細胞或細菌.

Ca++Mg++-ATP酶 (U/104細胞 )=銫×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]×Vrv÷(Vs÷V1×500)÷T

=0.015×[ΔA(時間)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(乙)]

CS: 標準管濃縮液, 0.5 微摩爾/毫升;

繩索: 總反應體積, 0.5 毫升; VS: 樣品量, 0.2 毫升;

心肺復甦: 樣品蛋白濃度 (毫克/毫升); 時間: 反應時間 (分分鐘), 1/6 小時;

瓦: 樣品重量 (G);

維: 試劑 I 的體積, 1 毫升;

500: 細菌或細胞的數量, 5 百萬.

筆記

1. 該試劑盒可以檢測 24 Ca++Mg++ -ATPase 樣本管 50 每個樣本需要一根管子作為對照.
2. 該方法具有追蹤的特點, 靈敏、快速. 測定用試管嚴格無磷. 避免磷污染是檢測成功的關鍵.

實驗範例:

1. 取出胰臟並添加 1 用於冰浴均質的試劑 I 的毫升數. 4℃離心後 10 分分鐘, 將上清液置於冰上，依測定步驟操作. ΔAT = 0.916-0.389=0.527, ΔAS =0.398-0.004=0.394

鈣++鎂++- ATP酶活性 (U/克質量) = 7.5 × ΔAT ÷ ΔAS ÷ W = 100.32 U/克質量.

2. 取柳葉0.1克，加入 1 mL 試劑 Ⅰ 冰浴均質. 4℃離心後 10 分分鐘, 將上清液置於冰上，依測定步驟操作. ΔAT=0.137-0.124=0.013, ΔAS=398-0.004=0.394

鈣 + + 鎂 + + – ATP酶活性 (U/克質量) = 7.5×ΔAT ÷ ΔAS ÷ W = 2.47 U/克質量.

參考

[1] 達泰萊斯 M J, 約翰遜E A, 麥卡蒂R E. 陽離子兩親物對 ATP 合成酶催化部分的 ATP 酶活性的抑制[J]. 生物化學與生物物理雜誌 (BBA)-生物能量學, 2008, 1777(4): 362-368.

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