ชุดทดสอบกิจกรรม Solarbio Ca++Mg++-ATPase

Ca++มก++-ATPase Activity Assay Kit

บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: สเปกโตรโฟโตมิเตอร์

หมายเลขแมว: BC0960

ขนาด: 50ที/24ส

ส่วนประกอบ:

รีเอเจนต์ I: ของเหลว 30 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ II: ของเหลว 4 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ III: ผง×2. การจัดเก็บที่ -20 ℃. Dissolve thoroughly with 1 ML ของน้ำกลั่นก่อนใช้งาน. The rest reagent can be kept at -20℃ for one week.

รีเอเจนต์ IV: ของเหลว 2 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ V: ผง×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. Dissolve thoroughly with 3 ML ของน้ำกลั่นก่อนใช้งาน. รีเอเจนต์ VI: ผง×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. Dissolve thoroughly with 15 ML ของน้ำกลั่นก่อนใช้งาน, can be kept at 4℃ for one week.

Reagent VII: ผง×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. Dissolve thoroughly with 15 ML ของน้ำกลั่นก่อนใช้งาน, can be kept at 4℃ for one week.

Reagent VIII: ของเหลว 15 มล.×1. Storage at RT.

โซลูชั่นมาตรฐาน: ของเหลว 1 มล.×1. 10 μmol/mL standard phosphorus liquid, การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

0.5 μmol/mL standard phosphorus working solution: Dilute the 10 μmol/mL standard 20 times with distilled water to 0.5 μmol/mL standard. ตัวอย่างเช่น: เพิ่ม 1.9 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นถึง 0.1 mL of standard, ผสมให้เข้ากัน.

Phosphorus fixing reagent:

Prepare reagents for determining phosphorus content: make solution as the volume ratio of H2O: รีเอเจนต์ VI: Reagent VII: Reagent VIII =2:1:1:1, which should be light yellow. It shows lose efficacy if color is changed, phosphorus pollution if color is change to blue. Prepare the reagent when it will be used.

บันทึก: It is better to use new beakers, glass rods and glass pipettes or disposable plastic ware when making reagent to avoid phosphorus pollution.

รายละเอียดสินค้า:

Ca++Mg++-ATPase is widely distributed in plants, สัตว์, microorganisms and cells, which catalyzes the hydrolysis of ATP to form ADP and inorganic phosphorus.

Ca++Mg++-ATPase decomposes ATP to produce ADP and inorganic phosphorus. The activity of ATPase can be detected by measuring the amount of inorganic phosphorus.

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์, เครื่องหมุนเหวี่ยงบนโต๊ะ, ปิเปตแบบปรับได้, อ่างอาบน้ำ, 1 คิวเวตต์แก้วขนาดมล, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, น้ำแข็งและน้ำกลั่น.

 

ขั้นตอน:

ฉัน. การจัดเตรียมตัวอย่าง:

1. แบคทีเรียหรือเซลล์:

Collecting bacteria or cells into a centrifuge tube, การหมุนเหวี่ยง, and discard supernatant. Suggest add 1mL of Reagent I to 5 แบคทีเรียหรือเซลล์ล้านล้าน. Use ultrasonic to splitting bacteria and cells (วางบนน้ำแข็ง, พลังงานอัลตราโซนิก 20%, เวลาทำงาน 3 วินาที, ช่วงเวลา 10 วินาที, ทำซ้ำเพื่อ 30 ครั้ง). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃ and take the supernatant on ice before testing.

2. เนื้อเยื่อ:

เพิ่ม 1 mL of Reagent I into 0.1 กรัมของเนื้อเยื่อ, บดน้ำแข็งจนสุด. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃ and take the supernatant on ice before testing.

3. เซรั่ม: Directly

ครั้งที่สอง. การกำหนด:

1. Preheat spectrophotometer for 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 660 นาโนเมตร, set the counter to zero with distilled water.
2. Add the following reagents to EP tube:

รีเอเจนต์ (ไมโครลิตร)	หลอดควบคุม (ค)	หลอดทดลอง (ต)
รีเอเจนต์ I	130	90
รีเอเจนต์ II	80	80
รีเอเจนต์ III	40	40
รีเอเจนต์ IV		40
ตัวอย่าง		200
ผสมให้เข้ากัน, then place the reaction solution in a 37℃ (สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) หรือ 25 ℃ (สายพันธุ์อื่น) อ่างน้ำสำหรับ 10 นาที.
รีเอเจนต์ V	50	50
ตัวอย่าง	200
ผสมให้เข้ากัน, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 4000 ×กรัม สำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง, เอาส่วนเหนือตะกอนไป.

3. Determination of phosphorus content, add the following reagents to 1.5 mL EP tube:

รีเอเจนต์ (ไมโครลิตร)	หลอดเปล่า (บี)	หลอดมาตรฐาน (ส)	หลอดควบคุม (ค)	หลอดทดลอง (ต)
0.5 μmol/mL standard phosphorus liquid		100
เหนือตะกอน			100	100
น้ำกลั่น	100
Reagents for determining phosphorus content	1000	1000	1000	1000

ผสมให้เข้ากัน, then place the mix solution in a 40℃water bath for 10 นาที. Cooling to room temperature and detect the absorbance at 660 นาโนเมตร. The blank tube and standard tube just need one or two tubes.

สาม. การคำนวณ:

1. เซรั่ม:

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the decomposed of ATP to produce 1 μmol of inorganic phosphorus per hour every milliliter of serum.

Ca++Mg++-ATPase (ยู/มล)=Cs×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]×Vrv÷s÷T

=7.5×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]

2. เนื้อเยื่อ, แบคทีเรีย, หรือ เซลล์

• ความเข้มข้นของโปรตีน:

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the decomposed of ATP to produce 1 μmol of inorganic phosphorus per hour every milligram of tissue protein.

Ca++Mg++-ATPase (U/มก)=Cs×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]×วีอาร์วี۞(เทียบกับ×ซีพีอาร์)÷T

=7.5×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]__ซีพีอาร์

• น้ำหนักตัวอย่าง:

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the decomposed of ATP to produce 1 μmol of inorganic phosphorus per hour, every milligram of tissue.

Ca++Mg++-ATPase (น้ำหนักยู/กรัม)=Cs×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]×วีอาร์วี۞(Vs÷V1×W)÷T

=7.5×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]۞W

• แบคทีเรียหรือเซลล์

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the decomposed of ATP to produce 1 μmol of inorganic phosphorus per hour every 10000 cells or bacteria.

Ca++Mg++-ATPase (U/104เซลล์ )=Cs×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]×วีอาร์วี۞(Vs÷V1×500)÷T

=0.015×[∆A(ต)-∆A(ค)]÷[∆A(ส)-∆A(บี)]

คส: Concentrate of standard tube, 0.5 ไมโครโมล/มล;

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด, 0.5 มล; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง, 0.2 มล;

ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน (มก./มล); ต: เวลาเกิดปฏิกิริยา (นาที), 1/6 ชั่วโมง;

ว: น้ำหนักตัวอย่าง (ก);

Vl: Volume of reagent I, 1 มล;

500: The amount of bacteria or cell, 5 ล้าน.

บันทึก

1. This kit can detect 24 tubes of Ca++Mg++ -ATPase samples in 50 tubes for each sample need one tube as control.
2. This method has the characteristics of trace, sensitive and rapid. The test tubes used for determination are phosphate-free strictly. Avoiding phosphorus pollution is the key to the success of detection.

ตัวอย่างการทดลอง:

1. Take of pancreas and add 1 mL of Reagent I for ice bath homogenization. After centrifugation at 4℃ for 10 นาที, the supernatant is put on the ice and operated according to the determination steps. ΔAT = 0.916-0.389=0.527, ΔAS =0.398-0.004=0.394

Ca++Mg++- ATPase activity (มวลยู/กรัม) - 7.5 × ΔAT ÷ΔAS ÷ W = 100.32 มวลยู/กรัม.

2. Take 0.1g of willow and add 1 mL of Reagent Ⅰ for ice bath homogenization. After centrifugation at 4℃ for 10 นาที, the supernatant is put on ice and operated according to the determination steps. The ΔAT=0.137-0.124=0.013, and the ΔAS=398-0.004=0.394

Ca + + มก + + – ATPase activity (มวลยู/กรัม) = 7.5×ΔAT ÷ ΔAS ÷ W = 2.47 มวลยู/กรัม.

อ้างอิง

[1] Datiles M J, Johnson E A, McCarty R E. Inhibition of the ATPase activity of the catalytic portion of ATP synthases by cationic amphiphiles[เจ]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2008, 1777(4): 362-368.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง

BC0060/BC0065 Na+K+ — ATPase Activity Assay Kit

BC0300/BC0305 ATP Activity Assay Kit