Соларбио сукцинатдегидрогеназа (СДХ) Набор для анализа активности

Сукцинатдегидрогеназа (СДХ) Набор для анализа активности

Примечание: Перед тестированием возьмите два или три разных образца для прогнозирования..

Оборудование обнаружения: Спектрофотометр

Кот нет: BC0950

Размер: 50Т/48С

Компоненты

Реагент I: 60 мл×1, хранить при -20℃. Реагент II: 0.6 мл×1, хранить при -20℃. Реагент III: 5 мл×1, хранить при 4℃.

Реагент IV: Порошок×1, хранить при 4℃. Когда решение будет использоваться, добавьте его в Реагент III, чтобы он растворился для использования..

Реагент V: Порошок×1, хранить при 4℃. Добавлять 4 мл дистиллированной воды, если будет использоваться раствор, неиспользованные реагенты хранятся при температуре 4 ℃..

Реагент VI: Порошок×1, хранить при -20℃. Добавлять 3.333 мл дистиллированной воды, если будет использоваться раствор, неиспользованные реагенты хранятся при температуре 4 ℃..

Описание

Сукцинатдегидрогеназа (СДХ, ЕС 1.3.5.1) широко встречается у животных, растения, микроорганизмы и культивируемые клетки. СДГ – маркерный фермент митохондрий., который представляет собой мембраносвязывающий фермент, расположенный на внутренней мембране митохондрий.. Это также один из ключевых моментов дыхательного переноса электронов и окислительного фосфорилирования.. Кроме того, он обеспечивает электронами дыхательную цепь различных прокариотических клеток..

СДГ может катализировать дегидрирование янтарной кислоты в фумаровую кислоту.. Дегидрирование может уменьшить 2,6-дихлорфенол индофенола. (ДКПИП) при переносе феназина диметилсульфата (ПМС). 2,6- DCPIP имеет характерный пик поглощения при 600 нм. Скорость восстановления 2,6-ДХПИП определяется изменением оптической плотности при 600 нм, который представляет активность фермента SDH.

Требуется, но не предусмотрено

Спектрофотометр, водяная баня, настольная центрифуга, регулируемая пипетка, ступка/гомогенизатор, 1 стеклянная кювета мл, лед и дистиллированная вода.

Протокол

я. Извлечение SDH:

Точно взвесить 0.1 г ткани или собрать 5 миллион клеток, добавлять 1 мл реагента I и 10 мкл реагента II, гомогенизировать с помощью гомогенизатора/раствора на ледяной бане, полностью измельчить, центрифуга в 11000 ×g для 10 минут при 4℃, возьмите супернатант и поместите его на лед для тестирования.

II. Процедура

1. Предварительно разогрейте спектрофотометр для 30 минуты, отрегулировать длину волны, чтобы 600 нм и установите ноль дистиллированной водой.
2. Процедура испытания

Название реагента (мкл)	Пробирка (Т)	Черная трубка (Б)
Реагент III	60	60
Реагент V	60	60
Дистиллированная вода	800	800
Сохраняйте тепло при 25 ℃(общий вид) или 37℃(млекопитающие) водяная баня для 10 минуты.
Образец	30	—
Дистиллированная вода	—	30
Реагент VI	30	30

Добавьте каждый реагент в 1 стеклянная кювета мл по очереди, и начните отсчет времени одновременно с добавлением реагента VI., записать начальное поглощение A1 на длине волны 600 нм для 20 секунды. Затем поместите кювету вместе с реакционным раствором на водяную баню с температурой 37℃. (млекопитающее) или 25℃ (другие виды), и точная реакция на 1 минута. Быстро достаньте кювету и высушите ее., и запишите поглощение A2 при 80 секунд в 600 нм. ΔА = А1-А2, получить ΔAT, ΔAB.

III. Расчет СДХ активность

Формула расчета для определения с 1 стеклянная кювета мл.

• Концентрация белка

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как количество фермента, катализирующего расходование 1 нмоль 2,6-дихлорфенола индофенола в минуту в реакционной системе на каждый миллиграмм тканевого белка.

СДХ(Ед/мг прот)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×ВРВ×109]÷(Цпр×ВС) ÷T＝1555,556×(ΔAT-ΔAB)÷Cpr

• Вес образца

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как количество фермента, катализирующего расходование 1 нмоль 2,6-дихлорфенола индофенола в минуту в реакционной системе на каждый грамм ткани.

СДХ(Ед/г)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×ВРВ×109]÷(ВС÷ВСТ×В) ÷T＝1571.111×(ΔAT-ΔAB)÷Вт

• Зародыш или клетки

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как количество фермента, катализирующего расходование 1 нмоль 2,6-дихлорфенола-индофенола в минуту в реакционной системе каждые 10 тысяча зародышей или клеток.

СДХ(Ячейка U / 104)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×ВРВ×109]÷(ВС÷ВСТ×500) ÷Т

＝3,142×(ΔAT-ΔAB)

ВРТ: Общий объем реакции, 0.98×10-3 л;

е: Молярный коэффициент экстинкции 2,6-ДХПИП, 2.1×104 л/моль/см; д: Световой диаметр кюветы, 1 см;

Против: Объем образца, 0.03 мл;

VST: Добавьте объем реагента I и реагента II., 1.01 мл; Т: Время реакции(мин), 1 минута;

КПР: Концентрация белка образца, мг/мл; Вт: Вес образца, г;

500: Клетки или зародыши, 5 миллион.

Примечание

1. Во время определения все реагенты и образцы должны быть помещены на лед во избежание денатурации и дезактивации..
2. Если ΔA больше, чем 0.5, раствор фермента следует разбавить экстрактом фермента, чтобы получить ΔA менее 0.5, что может улучшить чувствительность обнаружения.
3. Поскольку раствор экстракта содержит определенную концентрацию белка (о 1 мг/мл), при определении концентрации белка в образце необходимо вычесть содержание белка в самом растворе Экстракта..

Экспериментальный пример:

1. Возьмите 0,1 г почек., добавлять 1 мл реагента Ⅰ и 10 мкл Реагент Ⅱ, измельчить гомогенат на ледяной бане, центрифуга при 4 ℃ и 11000 г для 10 мин, и поместите супернатант на лед. По процедуре определения, активность фермента рассчитывают следующим образом: ΔАТ= А1Т- А2Т=0,82-0,681=0,139, ΔAB= А1В- А2В=905-0,904=0,001

SDH-деятельность (Ед/г массы) = 961,905×(ΔАТ- ΔAB) ÷ W =2168,13 Ед/г массы.

Рекомендации

• Фатторетти П, Бертони-Фреддари К, Казелли Ю, и другие. Нарушение сукцинатдегидрогеназной активности митохондрий клеток Пуркинье крыс при старении[Дж]. Механизмы старения и развития, 1998, 101(1-2): 175- 182.

сопутствующие товары

BC0710/BC0715 α-кетоглутаратдегидрогеназа(α-КГДГ) Набор для анализа активности

BC2150/BC2155 Лимонная кислота(Калифорния) Набор для анализа содержания

BC0380/BC0385 Пируватдегидрогеназа(ПДХ) Набор для анализа активности