Нитратредуктаза (NR) Набор для анализа (колориметрический метод Грисса)

Обзор продукта

NR (ЕС 1.7.1.3) широко найденный фермент в растениях. Он играет решающую роль в превращении нитратного азота в азот аммиака, а также индуцируемый фермент, влияя на урожайность и качество. NR катализирует восстановление нитрата на нитрит: №3- + NADH+ H+ → NO2- + Они+ + H2O. В кислых условиях, производимый №2- может участвовать в реакции диазотизации, чтобы сформировать соединение с пурпурным цветом. Это соединение имеет пик поглощения при 540 нм, и изменение поглощения в 540 NM может быть использован для представления активности ферментов.

Компоненты комплекта

• Индукторный запас решения: 50 мл x 1 бутылка
• Решение для экстракции: 30 мл x 1 бутылка
• Реагент Один: 12 мл x 1 бутылка
• Реагент второй: Порошок х 2 флаконы
• Реагент Три: 15 мл x 1 бутылка
• Реагент четвертый: 15 мл x 1 бутылка
• Стандартный: 1 мл x 1 флакон

Подготовка решения

1. Индуктивное решение: Разбавьте раствор индуктора в 10 раз с дистиллированной водой перед использованием. Брать 10 мл индуктивного запаса раствора и добавить 90 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать. Подготовьте свежие перед каждым использованием.
2. Реагент второй: Добавлять 1 мл дистиллированной воды. Аликвота и хранить при -20 ° C. Его можно хранить в течение 2 недели при -20 ° C.. Перед использованием, разбавить реагент в два 50 раз с дистиллированной водой. Брать 10 мкл реагента два и добавить 490 мкл дистиллированной воды. Хорошо перемешать.
3. Стандартный: Подготовить 0.1 мкмоль/мл стандартный раствор нитрита натрия, разбавив 10 мкмоль/мл стандартный раствор нитрита натрия в 100 раз с дистиллированной водой перед использованием.

Примечания

1. Если поглощение больше, чем 0.8, разбавить образец экстракционным раствором. Обратите внимание на корректировку коэффициента разведения соответственно в формуле расчета.
2. Строго следуйте порядок добавления реагентов, перечисленных в таблице анализа образцов для эксперимента.

Экспериментальные процедуры

я. Обработка образца

1. Предварительная обработка ткани:

   • Добавьте соответствующее количество индуктора в стакан. Вымойте свежие образцы, высушить их фильтровальной бумагой, и поместите их в решение индуктора (Достаточно, чтобы погрузиться). Инкубировать в темноте для 2 часы. Удалить образцы, высушить их фильтровальной бумагой, и заморозить при -20 ° C для 30 минуты. Образцы оттаивания и снова высушите их фильтрованной бумагой. (Выполнять индукционное лечение по мере необходимости. В целом, Индукционное лечение не требуется. Если результаты предварительного эксперимента не показывают активности, Индукционное лечение необходимо.)
   • Вес примерно 0.1 г образца и добавить 1 мл раствора экстракции в соответствии с соотношением веса ткани (г) для извлечения объема раствора (мл) из 1:5 к 10. Измельчать в ледяной ванне, центрифуга в 8000 г, 4°С для 10 минуты, и собрать супернатант. Держите супернатант на льду для тестирования.

2. Предварительная обработка клеток или бактерий:

   • Соберите образцы клеток или бактерий в центрифужную трубку и отбросьте супернатант. Добавлять 1 мл раствора экстракции на 5 миллионы клеток или бактерий. Умолчать бактерии или клетки (власть 200 Вт, ультразвание 3 секунды, интервал 10 секунды, повторить 30 раз). Центрифуга в 8000 г, 4°С для 10 минуты, соберите супернатант и храните его на льду для тестирования.

II. Анализ шагов

1. Разогреть видимый спектрофотометр, по крайней мере, по крайней мере 30 минуты, отрегулировать длину волны, чтобы 540 нм, и ноль дистиллированной водой.
2. Образец анализа: