ペルオキシダーゼ (ポッド) 活性アッセイキット
注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.
操作装置: 分光光度計 カタログ番号: BC0090 サイズ：50T/48S
コンポーネント:
抽出液: 60 mL×1. 4℃で保存.
試薬I: 40 mL×1. 4℃で保存.
試薬II: 0.5 mL×1. 4℃で保存. 使用前に遠心分離してください. 取る 0.22 試薬 II を mL 加えて加えます。 3.33 試薬I mL, 後で使用するために混ぜます (約27T). すぐに使えるように準備する, またはサンプル量に応じて比例的に調製することもできます.
試薬Ⅲ: 10 mL×1. 4℃で保存.
製品説明
ペルオキシダーゼ (ポッド, EC 1.11.1.7) 動物に広く存在する, 植物, そして微生物. 過酸化水素によるフェノールとアミンの酸化を触媒できます。, 過酸化水素の毒性を除去するという二重の効果があります。, フェノール, とアミン. 過酸化水素の存在下, POD は、H2O2 を触媒して特定の基質を酸化し、次のような吸収を持つ 1 つの物質を生成します。 470 nm.
必要だが提供されていない試薬と装置
分光光度計, 卓上遠心分離機, 転送者, 1 mLガラスキュベット, モルタル/ホモジナイザー, 氷と蒸留水.
手順
私. サンプルの準備:
あ. 細菌とか細胞とか
細菌や細胞を遠心管に集める, 遠心分離後、上清は廃棄されます. およそ摂取することをお勧めします 5 百万個の細菌/細胞を追加 1 抽出液 mL. 細菌または細胞は超音波処理によって分割されます (力: 20% または 200 W, 作業時間3秒, 間隔10秒, 繰り返します 30 回). で遠心分離します。 8000 rpm、4℃ 10 分, 上清は試験に使用されます.
B. 組織
およそ摂取することをお勧めします 0.1 ティッシュ1gを加えて 1 抽出液 mL, 氷上で完全に粉砕する.
で遠心分離します。 8000 の回転数 10 4℃で5分, 上清は試験に使用されます.
C. 血清 (プラズマ) サンプル: サンプルの検出
Ⅱ. 決定 手順
- 予熱用分光光度計 30 分, 波長を調整して 470 nm, 蒸留してゼロを設定する
- 試薬 I を配置します, 試薬 II および試薬 III 37℃ (哺乳類) または25℃(他の種) のために 10 数分前
- 次のリストを使用して試薬を追加します:
| 試薬名 (μL) | 試験管 |
| サンプル | 15 |
| 蒸留水 | 270 |
| 試薬I | 520 |
| 試薬II | 130 |
| 試薬Ⅲ | 135 |
上記の試薬を加えると、 1 mL ガラスキュベットを順番に, すぐに混ぜて時間を計る. 吸光度値 A1 は、 30 90年代のsとA2 470 nmが記録されています, ΔA＝A2-A1.
Ⅲ. 計算
私. 血清 (プラズマ)サンプル
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、酵素の吸光度を触媒する酵素の量として定義されます。 0.01 に変更します 470 反応系内の nm/分/血清 1 ミリリットルあたり (プラズマ).
ポッド(U/mL)=ΔA×Vrv÷Vsv÷0.01÷T =7133×ΔA
Ⅱ. 組織, 細菌または培養細胞
あ. タンパク質濃度
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、酵素の吸光度を触媒する酵素の量として定義されます。 0.01 に変更します 470 反応系内の nm/分/タンパク質 1 ミリグラム.
ポッド(U/mgプロット)＝ΔA×Vrv÷(vsv×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
B. サンプル重量
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、酵素の吸光度を触媒する酵素の量として定義されます。 0.01 に変更します 470 反応系内での 1 分間あたりの nm、組織グラムごと.
ポッド(U/生重量g)＝ΔA×Vrv÷(W×Vsv÷Vs)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
C. セラマウント
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、酵素の吸光度を触媒する酵素の量として定義されます。 0.01 に変更します 470 反応系内の nm/分/分 10 千の細菌または細胞.
ポッド(U/104セル)＝ΔA×Vrv÷(500×Vsv÷Vs)÷0.01÷T =14.27×ΔA
ロープ: 総反応量, 1.07 mL; VSv: 上清の総量, 0.015 mL; 対: 抽出液量, 1 mL;
T: 反応時間, 1 分;
心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL; W: サンプル重量, g;
500: 細菌または細胞の総数, 5 百万.
注記:
- 一度に測定するサンプルが多い場合, 試薬Iの混合物, Ⅱ, IIIと蒸留水を比例して調製できます。, 混合物は37℃に置くことができます (哺乳類) または25℃ (他の種) 以上 10 分. 15 μLのサンプルと 1055 測定のために μL の混合物を追加できます.
- ΔA が以下の場合 0.005, 反応時間は次のように延長できます 5 分. ΔAがより大きい場合 0.5 または反応液中に気泡が多くなっている, サンプルを抽出物で希釈して測定することができます, 計算式に対応する希釈率を掛けます。.
参考文献
- レウヴェニ R . マスクメロンの耐性の生化学マーカーとしてのペルオキシダーゼ活性 ( キュウリメロン ) シュードペロノスポラ・キュベンシスに[J]. 植物病理学, 1992,82(7).
- ドルゲ DR , ディビ R L , チャーチウェル M I . ペルオキシダーゼによって生成される着色グアヤコール酸化生成物の同定[J]. 分析生化学, 1997,250(1):10-17.
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