Solarbi Ca++Mg++-ATPase 活性アッセイキット

Ca++マグネシウム++-ATPアーゼ活性アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

操作装置: 分光光度計

カタログ番号: BC0960

サイズ: 50T/24S

コンポーネント:

試薬I: 液体 30 mL×1. 4℃で保存.

試薬II: 液体 4 mL×1. 4℃で保存.

試薬Ⅲ: パウダー×2. -20℃で保管. でよく溶かしてください 1 使用前に蒸留水 mL. 残りの試薬は-20℃で1週間保存可能.

試薬IV: 液体 2 mL×1. 4℃で保存.

試薬V: パウダー×1. 4℃で保存. でよく溶かしてください 3 使用前に蒸留水 mL. 試薬VI: パウダー×1. 4℃で保存. でよく溶かしてください 15 使用前に蒸留水 mL, 4℃で1週間保存可能.

試薬VII: パウダー×1. 4℃で保存. でよく溶かしてください 15 使用前に蒸留水 mL, 4℃で1週間保存可能.

試薬 VIII: 液体 15 mL×1. 室温での保管.

標準溶液: 液体 1 mL×1. 10 μmol/mL標準リン液, 4℃で保存.

0.5 μmol/mL リン標準作業溶液: 希釈してください 10 μmol/mL標準 20 蒸留水で数回 0.5 μmol/mL標準. 例えば: 追加 1.9 蒸留水 mL ～ 0.1 標準液 mL, 十分に混ぜる.

リン固定試薬:

リン含有量を測定するための試薬を調製する: H2Oの体積比で溶液を作る: 試薬VI: 試薬VII: 試薬 VIII =2:1:1:1, 薄黄色になるはずです. 色が変わると効果がなくなる, 色が青に変わったらリン汚染. 試薬を使用するときに準備します.

注記: 新しいビーカーを使用した方が良いです, リン汚染を避けるために試薬を作る際には、ガラス棒とガラスピペット、または使い捨てのプラスチック製品を使用する.

製品説明:

Ca++Mg++-ATPase は植物に広く分布しています, 動物, 微生物と細胞, ATPの加水分解を触媒してADPと無機リンを形成します.

Ca++Mg++-ATPase は ATP を分解して ADP と無機リンを生成します. 無機リンの量を測定することでATPaseの活性を検出できます.

必要だが提供されていない試薬と装置:

分光光度計, 卓上遠心分離機, 調整可能なピペット, 水浴, 1 mLガラスキュベット, モルタル/ホモジナイザー, 氷と蒸留水.

 

手順:

私. サンプルの準備:

1. 細菌とか細胞とか:

細菌や細胞を遠心管に集める, 遠心分離, そして上清を捨てます. 試薬 I を 1 mL 加えるとよいでしょう。 5 数百万の細菌または細胞. 超音波を使用して細菌と細胞を分割します (氷の上に置かれた, 超音波パワー 20%, 労働時間 3 秒, 間隔 10 秒, 繰り返します 30 回). で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 4℃で3分間放置し、試験前に上清を氷上に採取します。.

2. 組織:

追加 1 試薬 I を mL に注入 0.1 組織グラム, 氷上で完全に粉砕する. で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 4℃で3分間放置し、試験前に上清を氷上に採取します。.

3. 血清: 直接

Ⅱ. 決定:

1. 予熱用分光光度計 30 分, 波長を調整して 660 nm, 蒸留水でカウンターをゼロに設定します.
2. 以下の試薬を EP チューブに添加します。:

試薬 (μL)	コントロールチューブ (C)	試験管 (T)
試薬I	130	90
試薬II	80	80
試薬Ⅲ	40	40
試薬IV		40
サンプル		200
十分に混ぜ合わせてください, 反応液を37℃の恒温槽に置きます。 (哺乳類) または25℃ (他の種) 水浴用 10 分.
試薬V	50	50
サンプル	200
十分に混ぜ合わせてください, で遠心分離する 4000 ×gの場合 10 室温で数分, 上清を取る.

3. リン含有量の測定, 以下の試薬を加えます 1.5 mL EPチューブ:

試薬 (μL)	ブランクチューブ (B)	標準チューブ (S)	コントロールチューブ (C)	試験管 (T)
0.5 μmol/mL標準リン液		100
上清			100	100
蒸留水	100
リン含有量を測定するための試薬	1000	1000	1000	1000

十分に混ぜ合わせてください, 混合溶液を40℃のウォーターバスに入れ、 10 分. 室温まで冷却し、吸光度を検出します。 660 nm. ブランクチューブと標準チューブは 1 つまたは 2 つのチューブだけで済みます.

Ⅲ. 計算:

1. 血清:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、ATP を分解して生成する酵素の量として定義されます。 1 血清 1 ミリリットルあたり、1 時間あたりの無機リンのμmol.

Ca++Mg++-ATPアーゼ (U/mL)=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷s÷T

=7.5×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]

2. 組織, 細菌, または 細胞

• タンパク質濃度:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、ATP を分解して生成する酵素の量として定義されます。 1 組織タンパク質 1 ミリグラム当たりの 1 時間あたりの無機リンのμmol.

Ca++Mg++-ATPアーゼ (U/mgプロット)=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(VS×CPR)÷T

=7.5×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]÷心肺蘇生法

• サンプル重量:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、ATP を分解して生成する酵素の量として定義されます。 1 1時間あたりの無機リンのμmol, 組織のあらゆるミリグラム.

Ca++Mg++-ATPアーゼ (U/g重量)=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(Vs÷V1×W)÷T

=7.5×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]÷W

• 細菌とか細胞とか

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、ATP を分解して生成する酵素の量として定義されます。 1 1時間あたりの無機リンのμmol 10000 細胞とか細菌とか.

Ca++Mg++-ATPアーゼ (U/104セル )=Cs×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(Vs÷V1×500)÷T

=0.015×[ΔA(T)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]

Cs: 標準チューブの濃縮物, 0.5 μmol/mL;

ロープ: 総反応量, 0.5 mL; 対: サンプル量, 0.2 mL;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度 (mg/mL); T: 反応時間 (分), 1/6 時間;

W: サンプル重量 (g);

Vl: 試薬Iの量, 1 mL;

500: 細菌または細胞の量, 5 百万.

注記

1. このキットで検出できるのは、 24 Ca++Mg++ -ATPase サンプルのチューブ 50 各サンプルのチューブにはコントロールとして 1 つのチューブが必要です.
2. この方法にはトレースという特徴があります。, 敏感かつ迅速な. 測定に使用される試験管は厳密にリン酸塩を含まないものです。. リン汚染を回避することが検出成功の鍵です.

実験例:

1. 膵臓を取り出して加える 1 氷浴均質化用試薬 I mL. 4℃で1時間遠心分離した後、 10 分, 上清を氷上に置き、測定手順に従って操作します。. ΔAT = 0.916-0.389=0.527, ΔAS =0.398-0.004=0.394

Ca++Mg++- ATPアーゼ活性 (U/g質量) = 7.5 × ΔAT ÷ ΔAS ÷ W = 100.32 U/g質量.

2. ヤナギ0.1gを取り、加えます 1 氷浴均質化用試薬Ⅰ mL. 4℃で1時間遠心分離した後、 10 分, 上清を氷上に置き、測定手順に従って操作します。. ΔAT=0.137-0.124=0.013, ΔAS=398-0.004=0.394

Ca + + マグネシウム + + – ATPアーゼ活性 (U/g質量) = 7.5×ΔAT ÷ ΔAS ÷ W = 2.47 U/g質量.

参考文献

[1] ダタイルズ M J, ジョンソン E・A, マッカーティ R E. カチオン性両親媒性物質によるATP合成酵素の触媒部分のATPアーゼ活性の阻害[J]. 生化学および生物物理ジャーナル (BBA)-生体エネルギー学, 2008, 1777(4): 362-368.

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