Kit de ensayo de actividad Solarbio Ca++Mg++-ATPasa

California++Mg++-Kit de ensayo de actividad de ATPASE

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: espectrofotómetro

No gato: BC0960

Tamaño: 50T/24S

Componentes:

reactivo yo: Líquido 30 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo II: Líquido 4 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo III: Polvo×2. Almacenamiento a -20 ℃. Disolver a fondo con 1 ml de agua destilada antes de usar. El reactivo de descanso se puede mantener en -20 ℃ durante una semana.

Reactivo IV: Líquido 2 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo V: Polvo × 1. Almacenamiento a 4 ℃. Disolver a fondo con 3 ml de agua destilada antes de usar. Reactivo VI: Polvo × 1. Almacenamiento a 4 ℃. Disolver a fondo con 15 ml de agua destilada antes de usar, se puede mantener a las 4 ℃ durante una semana.

Reactivo vivo: Polvo × 1. Almacenamiento a 4 ℃. Disolver a fondo con 15 ml de agua destilada antes de usar, se puede mantener a las 4 ℃ durante una semana.

Reactivo VIII: Líquido 15 mL×1. Almacenamiento en RT.

Solucion estandar: Líquido 1 mL×1. 10 μmol/ml de líquido de fósforo estándar, Almacenamiento a 4 ℃.

0.5 Solución de trabajo de fósforo estándar de μmol/ml: Diluir el 10 μmol/ml estándar 20 veces con agua destilada para 0.5 μmol/ml estándar. Por ejemplo: agregar 1.9 mL de agua destilada para 0.1 ml de estándar, mezclar bien.

Reactivo de fijación de fósforo:

Prepare reactivos para determinar el contenido de fósforo: Haga una solución como la relación de volumen de H2O: Reactivo VI: Reactivo vivo: Reactivo VIII = 2:1:1:1, que debería ser amarillo claro. Muestra la eficacia de perder si se cambia el color, contaminación del fósforo si el color se cambia a azul. Prepare el reactivo cuando se use.

Nota: Es mejor usar nuevos vasos, varillas de vidrio y pipetas de vidrio o vajillas de plástico desechables al hacer reactivos para evitar la contaminación del fósforo.

Descripción del Producto:

Ca ++ Mg ++: la ATPasa se distribuye ampliamente en las plantas, animales, microorganismos y células, que cataliza la hidrólisis de ATP para formar ADP y fósforo inorgánico.

Ca ++ Mg ++: ATPasa descompone ATP para producir ADP y fósforo inorgánico. La actividad de la ATPasa se puede detectar midiendo la cantidad de fósforo inorgánico.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:

espectrofotómetro, centrífuga de escritorio, pipeta ajustable, baño de agua, 1 cubeta de vidrio de ml, mortero/homogeneizador, hielo y agua destilada.

 

Procedimiento:

I. preparación de la muestra:

1. Bacterias o células:

Recolectando bacterias o células en un tubo de centrífuga, centrifugación, y descartar sobrenadante. Sugerir agregar 1 ml de reactivo I a 5 millones de bacterias o células. Use ultrasónico para dividir bacterias y células (colocado sobre hielo, poder ultrasónico 20%, tiempo de trabajo 3 segundos, intervalo 10 segundos, repetir para 30 veces). Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃ y tome el sobrenadante en el hielo antes de probar.

2. Tejido:

Agregar 1 ml de reactivo I en 0.1 g de tejido, moliendo completamente sobre hielo. Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃ y tome el sobrenadante en el hielo antes de probar.

3. Suero: Directamente

II. Determinación:

1. Precalentar el espectrofotómetro para 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 660 Nuevo Méjico, Establezca el mostrador en cero con agua destilada.
2. Agregue los siguientes reactivos al tubo EP:

Reactivo (µL)	tubo de control (C)	Tubo de ensayo (t)
reactivo yo	130	90
Reactivo II	80	80
Reactivo III	40	40
Reactivo IV		40
Muestra		200
Mezclar bien, Luego coloque la solución de reacción en un 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃ (otras especies) baño de agua para 10 minutos.
Reactivo V	50	50
Muestra	200
Mezclar bien, centrifugar en 4000 ×g para 10 minutos a temperatura ambiente, tomar el sobrenadante.

3. Determinación del contenido de fósforo, Agregue los siguientes reactivos a 1.5 Ml Tube EP:

Reactivo (µL)	tubo en blanco (B)	tubo estándar (S)	tubo de control (C)	Tubo de ensayo (t)
0.5 μmol/ml de líquido de fósforo estándar		100
Flotante			100	100
Agua destilada	100
Reactivos para determinar el contenido de fósforo	1000	1000	1000	1000

Mezclar bien, Luego coloque la solución de mezcla en un baño de agua de 40 ℃ para 10 minutos. Enfriamiento a temperatura ambiente y detectar la absorbancia en 660 Nuevo Méjico. El tubo en blanco y el tubo estándar solo necesitan uno o dos tubos.

III. Cálculo:

1. Suero:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la descompuesta de ATP para producir 1 μmol de fósforo inorgánico por hora cada mililitro de suero.

Ca ++ Mg ++-ATPASE (unidades/mL)= CS ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]× VRV ÷ S ÷ t

= 7.5 ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]

2. Tejido, bacterias, o células

• Concentración de proteínas:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la descompuesta de ATP para producir 1 μmol de fósforo inorgánico por hora cada miligramo de proteína tisular.

Ca ++ Mg ++-ATPASE (Prot. U/mg)= CS ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(Vs×Cpr)÷ t

= 7.5 ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]÷Cpr

• Peso de la muestra:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la descompuesta de ATP para producir 1 μmol de fósforo inorgánico por hora, Cada miligramo de tejido.

Ca ++ Mg ++-ATPASE (Peso U/g)= CS ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(VS ÷ V1 × W)÷ t

= 7.5 ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]÷W

• bacterias o células

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la descompuesta de ATP para producir 1 μmol de fósforo inorgánico por hora cada 10000 células o bacterias.

Ca ++ Mg ++-ATPASE (U/104 celdas )= CS ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]×Vrv÷(VS ÷ V1 × 500)÷ t

= 0.015 ×[ΔA(t)-ΔA(C)]÷[ΔA(S)-ΔA(B)]

CS: Concentrado de tubo estándar, 0.5 µmol/mL;

Soga: Volumen total de reacción, 0.5 mililitros; contra: Volumen de la muestra, 0.2 mililitros;

RCP: Concentración de proteína de muestra (mg/mL); t: Tiempo de reacción (mín.), 1/6 hora;

W.: Peso de la muestra (gramo);

VL: Volumen de reactivo I, 1 mililitros;

500: La cantidad de bacterias o células, 5 millón.

Nota

1. Este kit puede detectar 24 Tubos de muestras de Ca ++ Mg ++ -ATPasa en 50 Los tubos para cada muestra necesitan un tubo como control.
2. Este método tiene las características de Trace, sensible y rápido. Los tubos de ensayo utilizados para la determinación no tienen fosfato estrictamente. Evitar la contaminación del fósforo es la clave para el éxito de la detección.

Ejemplo experimental:

1. Tomar pancreas y agregar 1 ml de reactivo I para homogeneización de baño de hielo. Después de la centrifugación a las 4 ℃ 10 mín., El sobrenadante se coloca en el hielo y se opera de acuerdo con los pasos de determinación. ΔAT = 0.916-0.389 = 0.527, ΔAS = 0.398-0.004 = 0.394

Ca ++ mg ++- Actividad ATPasa (masa U/g) = 7.5 × Δat ÷ ΔAs ÷ W = 100.32 masa U/g.

2. Tomar 0.1g de sauce y agregar 1 ml de reactivo ⅰ para homogeneización de baño de hielo. Después de la centrifugación a las 4 ℃ 10 mín., El sobrenadante se pone en hielo y se opera de acuerdo con los pasos de determinación. El Δat = 0.137-0.124 = 0.013, y el ΔAS = 398-0.004 = 0.394

California + + Mg + + – Actividad ATPasa (masa U/g) = 7.5 × Δat ÷ ΔAs ÷ W = 2.47 masa U/g.

Referencias

[1] Datiles m j, Johnson por un, McCarty R E. Inhibición de la actividad de ATPasa de la porción catalítica de ATP sintasas por anfifílicos catiónicos[j]. Bioquímica y biofísica Acta (BBA)-Bioenergética, 2008, 1777(4): 362-368.

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