1. Componenti del kit di reagenti
| Specifiche | 50T | 100T |
| Gatto. NO. | SN0253 | SN0254 |
| Colonne di estrazione del DNA (impostato) | 50 (impostato) | 100 (impostato) |
| Tampone reagente SP | 20 ml | 2 × 20 ml |
| Tampone reagente C | 30 ml | 2 × 30 ml |
| Tampone di lavaggio 1 | 15 ml | 2 × 15 ml |
| Tampone di eluizione | 20 ml | 20 ml |
| Proteinasi K | 1ml | 2x1 ml |
| RNasiA | 1ml | 2x1 ml |
| Manuale di istruzioni | 1 | 1 |
2. Magazzinaggio
Questo kit di reagenti deve essere conservato a temperatura ambiente (15-25℃) e in condizioni asciutte, con una durata di conservazione di 12 mesi. Le colonne di purificazione per l'estrazione del DNA possono essere conservate per 1 anno in un ambiente fresco e asciutto. Proteinasi K e RNasi A contengono conservanti, consentendo il trasporto a temperatura ambiente, ma per la conservazione a lungo termine, dovrebbero essere mantenuti a -20 ℃.
3. Istruzioni per l'uso del kit di reagenti
3.1 Questo kit di reagenti è destinato alla ricerca di biologia molecolare e non deve essere utilizzato per la diagnosi o il trattamento di malattie.
3.2 Alcuni componenti del kit di reagenti contengono sostanze irritanti. Si raccomandano misure protettive come indossare indumenti protettivi e occhiali protettivi.
3.3 Durante l'utilizzo di questo kit di reagenti, una centrifuga ad alta velocità, bagnomaria (bagno di metallo), miscelatore a vortice, etanolo anidro, acqua deionizzata sterile, e le provette EP devono essere preparate dall'utente.
4. Introduzione al kit di reagenti
Il campione di sperma estrazione del DNA genomico il kit fornisce una soluzione di purificazione rapida ed efficiente per il DNA dei campioni di sperma. Raggiunge il campione Purificazione del DNA efficacemente attraverso un sistema tampone di estrazione dedicato combinato con specifiche colonne di purificazione degli acidi nucleici.
Questo kit può estrarre il DNA del campione di sperma all'interno 30 minuti, e l'intero processo di purificazione non richiede reagenti tossici come il fenolo-cloroformio. Il DNA estratto può essere utilizzato direttamente per PCR, Southernblotting, e altre applicazioni.
5. Principi e procedure sperimentali
6. Processo di estrazione
Prima di iniziare l'esperimento:
UN.Tampone reagente SP:Questo buffer deve essere conservato a lungo termine in un ambiente tra 2 ℃ e 8 ℃
B.Tampone reagente C può precipitare in condizioni di bassa temperatura. Si consiglia di riscaldare a 65 ℃ per 5 minuti. Dopo che il precipitato si è sciolto, può essere utilizzato normalmente.
C.Tampone di lavaggio 1: Prima dell'uso, aggiungere la quantità specificata di etanolo anidro come indicato sull'etichetta del flacone del reagente. Contrassegnare un segno di spunta sull'etichetta per indicare l'aggiunta di etanolo anidro.
D. Il tampone di eluizione è un 0.1x soluzione TE contenente una quantità minima di EDTA. Se l'EDTA ha un impatto sugli esperimenti successivi, si consiglia di utilizzare acqua deionizzata sterile come sostituto del tampone di eluizione.
- Elaborazione del campione:
Pipetta 200ml di sperma congelato, incubare a 75 ℃ per 10 minuti fino a quando il campione di sperma non sarà viscoso. Centrifugare a 12000 giri al minuto per 5 minuti, aspirare quanto più possibile il surnatante, e gli spermatozoi si depositeranno sul fondo della provetta.
- Aggiungi al sedimento del passaggio precedente: 400µl di tampone reagente SP, 20µl di proteinasi K (10 mg/ml), 20µl di RNasiA (10 mg/ml).Digerire a 65 ℃ per 10 minuti, capovolgere e mescolare 6-7 volte durante la digestione finché il campione non è completamente digerito.
- Aggiungere un volume uguale di Tampone reagente C e un volume uguale di etanolo anidro, e mescolare bene pipettando.
(Per esempio: Se si aggiungono 400μl di Reagent Buffer IV, sarà necessario aggiungere circa 460μl di Reagent Buffer C e 460μl di etanolo anidro. Dopo l'aggiunta del tampone reagente C potrebbe formarsi una piccola quantità di precipitato, ma non influisce sugli esperimenti successivi.)
- Trasferire il liquido ottenuto in una colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (cassetta) (circa 650-700μl ogni volta). Lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 2 minuti, centrifugare al massimo 8,000 giri al minuto per 1 minuto, smaltire il liquido di scarto raccolto, e reinserire il tubo di raccolta nella colonna di purificazione per il passaggio successivo.
- Ripeti il passaggio 4, aggiungendo il liquido rimanente alla colonna di purificazione dell'estrazione del DNA (cassetta), centrifugare al massimo 8,000 giri al minuto per 1 minuto, eliminare il liquido di scarto e il tubo di raccolta.
- Posizionare la colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (cassetta) nel tubo di raccolta, aggiungere 300 ml di tampone di lavaggio 1, centrifugare al massimo 8,000 giri al minuto per 1 minuto, eliminare il liquido di scarto, e posizionare la colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (cassetta) nuovamente nel tubo per il passaggio successivo.
(Nota: Confermare che l'etanolo anidro sia stato aggiunto al tampone di lavaggio 1.)
- Aggiungere 500ml di tampone di lavaggio 1 alla colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (cassetta), centrifugare a 14,000 giri/min (20,000× g) per 2 minuti, prolungare opportunamente il tempo di centrifugazione per asciugare la membrana più a fondo.
- Posizionare la colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (cassetta) in una nuova provetta da centrifuga, aprire il coperchio, incubare a 65 ℃ per 2 minuti. Se necessario, estendere questo passaggio per far evaporare l'etanolo il più possibile, impedendo ai residui di etanolo di influenzare gli esperimenti a valle.
- Sospensione 50-100μl di tampone di eluizione sulla membrana, centrifugare a 12,000 giri al minuto per 2 minuti.
(Nota: 1. L'utilizzo di 50μl di tampone di eluizione per eluire il DNA può aumentare la concentrazione del DNA ma diminuisce la resa complessiva del DNA. 2. Il DNA eluito può essere riapplicato alla colonna di purificazione per l'estrazione del DNA, centrifugato a 12,000 giri al minuto per 2 ancora qualche minuto, per aumentare la resa del DNA.)
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