Solarbio Creatina Chinasi (CK) Kit di analisi dell'attività

Creatina chinasi (CK) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Spettrofotometro

Gatto n: BC1140

Misurare:50T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: 60 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente I: polvere × 1, Conservato al buio a -20 ℃. Sciolto in 10 ml di acqua distillata prima dell'uso, Il reagente inutilizzato deve essere conservato a -20 ℃ dopo il reimballaggio, Sono vietati il ​​congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Reagente II: polvere × 1, memorizzato a -20 ℃. Sciolto in 0.5 ml di acqua distillata prima dell'uso, Il reagente inutilizzato deve essere conservato a -20 ℃ dopo il reimballaggio, Sono vietati il ​​congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Reagente III: polvere × 2, memorizzato a -20 ℃. Sciolto in 0.5 ml di acqua distillata prima dell'uso, I reagenti che non possono essere utilizzati devono essere conservati a -20 ℃ dopo il reimballaggio, Sono vietati il ​​congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Reagente IV: polvere × 1, memorizzato a -20 ℃. Sciolto in 0.65 ml di acqua distillata prima dell'uso, Il reagente inutilizzato deve essere conservato a -20 ℃ dopo il reimballaggio, Sono vietati il ​​congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Reagente V: 15 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

 

Descrizione del prodotto:

Creatina chinasi (CK) (CE 2.7.3.2) è anche noto come creatina fosfokinasi, che esiste principalmente nel cuore, muscolo, e cervello. Può catalizzare reversibilmente la reazione trans-fosforo tra creatina e ATP. È una chinasi importante direttamente correlata al trasporto di energia cellulare, contrazione muscolare e rigenerazione ATP.

CK catalizza la creatina fosfato e l'ADP per generare creatina e ATP, L'esocinasi catalizza ATP e glucosio per generare glucosio-6-fosfato, e il glucosio-6-fosfato deidrogenasi catalizza il glucosio-6- fosfato e NADP+ per generare NADPH, con conseguente aumento di 340 valore di assorbimento della luce nm, che viene utilizzato per esprimere l'attività dell'enzima CK.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti

Scale, centrifuga a bassa temperatura, bagnomaria a temperatura costante, spettrofotometro, 1 ml di cuvetta in quarzo e acqua distillata.

Procedura

IO. Estrazione della soluzione di enzima grezzo:

1. 1. Campione di tessuto:

La proporzione di massa tissutale (G): Volume della soluzione di estratto (ml): 1:5~10 (Si consiglia di pesare 0.1 g di tessuto, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto) per l'omogeneità del bagno di ghiaccio. Centrifugare a 10000 ×g per 15 minuti a 4 ℃, prendi il surnatante e mettilo sul ghiaccio per il test.

2. Campione di siero:

Determinazione diretta.

3. Campione cellulare:

Il numero di cellule (104): il volume della soluzione di estrazione(ml) è 500 ~ 1000:1 (1 Si consiglia di aggiungere ml di soluzione di estratto 5 milioni di cellule), Viene aggiunta la soluzione di estratto, e le cellule sono spezzate dall'onda ad ultrasuoni nel bagno di ghiaccio (Energia: 300W, ultrasonico: 3S, intervallo: 7S, tempo totale: 3 minuti). Centrifugare a, 10000×g per 10 minuti a 4 ℃, il surnatante e posizionarlo sul ghiaccio per il test.

II. Test procedura:

1. Preriscaldare lo spettrofotometro per più di 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 340 nm, e regolare a zero con acqua distillata.
2. Soluzione funzionante: Mescola il reagente i, Reagente II, Reagente III, Reagente IV e reagente V nella proporzione di 70:4:7:10:90 (Rapporto di volume) prima dell'uso. Preparati quando verrà utilizzata la soluzione. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso (Questo passaggio non può essere omesso).
3. Tavolo operatorio: Aggiungi i seguenti reagenti in 1 ml cuvette

Nome del reagente (μL)	Tubo vuoto (AB)	Provetta (A)
Soluzione enzimatica grezza	–	200
Soluzione funzionante	450	450
Acqua distillata	550	350
Aggiungere i reagenti di cui sopra nel 1 ml rispettivamente di cuvette in quarzo, mescolali bene e misura il valore di assorbanza a1 340 nm per 10 S, posizionarli rapidamente in un bagno d'acqua 37 ℃ per 3 minuti (Il lettore di micropiastre a temperatura controllata può essere impostato su 37 ℃), Elimina il valore di assorbanza A2 a 190 s e calcolare Δat = a2t- A1t, ΔAB = A2B- A1b, ΔA = ΔAT-ΔAB. Blank Tube deve essere fatto solo 1-2 volte.

III. Calcolo di CK:

• Calcolato dalla concentrazione di proteine ​​tissutali:

Definizione di attività enzimatica: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima catalizza la produzione di 1 nmolof nadph al minuto a 37 ℃ e ph7,0 ogni milligrammo di proteine.

Attività CK (U/mg prot) = ΔA ÷(ε×d)× VRT × 109 ÷ (Vs × cpr) ÷ t = 268 × ΔA ÷ cpr

• Calcolato dalla qualità dei campioni di tessuto:

Definizione di attività enzimatica: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima catalizza la produzione di 1 nmol di NADPH al minuto a 37 ℃ e ph7,0 in ogni grammo di campione.

Attività CK (U/g peso fresco) = ΔA ÷(ε×d)× VRT × 109 ÷ (VS÷VST×W) ÷ t = 268 × ΔA ÷ w

• Calcolato per volume sierico:

Definizione di attività enzimatica: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima catalizza la produzione di 1 nmol di NADPH al minuto a 37 ℃ e ph7,0 in ogni millilitro di siero.

Attività CK (U/ml) = ΔA ÷(ε×d)× VRV × 109 ÷ vs ÷ T = 268 × ΔA

• Per conteggio delle cellule:

Definizione di attività enzimatica: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima catalizza la produzione di 1 nmol di NADPH al minuto a 37 ℃ e ph7,0 10000 cellule.

Attività CK (Cella U/104)=ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(Vs ÷ vst × n)÷ t = 268 × ΔA ÷ n

 

e: Coefficiente di estinzione molare di NADPH, 6.22×103 L/mol/cm; D: Diametro leggero di cuvetta, 1 cm;

VRT: Volume totale del sistema di reazione, 0.001 ml;

VS: Il volume del campione nel sistema di reazione, 0.2 ml; VST: Il volume della soluzione di estratto, 1 ml;

Cpr: Concentrazione proteica del campione, mg/ml; W: La massa di massa campione, G;

N: Il numero di cellule, 104 unità; T: tempo di reazione, 3 minuti.

Nota:

1. Il ck del siero non è stabile. I campioni vengono raccolti e misurati il ​​prima possibile. Il ck del siero è stabile per 24 Ore dopo essere stata conservata a 4 ℃ al buio.
2. Il contenuto proteico del campione deve essere determinato separatamente. proteina BCA Il kit di determinazione del contenuto può essere utilizzato per la determinazione.
3. Se il valore OD è maggiore di 0.6, Il campione può essere diluito correttamente con la soluzione di estratto, e la formula di calcolo può essere modificata in base al rapporto di diluizione.
4. ΔAB generalmente non supera 01.

Istanze sperimentali：

1. Prendi 0,1 g di cervello di topo, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, omogenare e macinare. Prendi il surnatante, Quindi diluire con estratto 4 tempi e rilevare in base ai passaggi misurati. Calcola ΔAT = A2T- A1T = 0,638-0.149 = 0,489, ΔAB = A2B-A1B = 0， ΔA = ΔAT-ΔAB = 0,489-0 = 0,489, calcolare l'attività enzimatica in base al peso del campione:

Attività CK （U/G Peso） = 268 × ΔA ÷ W × 4 （Rapporto diluizione） = 268 × 0,489 ÷ 0,1 × 4 （rapporto diluizione）

= 5242.08u/g di peso.

2. Prendi 200 μl di siero di anatra per rilevare direttamente, Calcola ΔAT = A2T-A1T = 0,445-0.423 = 0,022, ΔAB = A2B- A1b = 0, ΔA = ΔAT-ΔAB = 0,022-0 = 0,022, Calcola l'attività enzimatica in base al volume del siero:

Attività CK （u/ml） = 268 × ΔA = 268 × 0,022 = 5,896 U/ml.

Riferimenti：

• Defang Li, In lu, Jichunhan, et al.eriodictyol attenua le lesioni miocardiche dell'ischemia-riperfusione attraverso l'attivazione di JAK2. Frontiers in Immunology. Gennaio2018;(IF3.845)
• Xu y, Meng x, Hou x, et al. Un mutante del peptide antitumorale-analgesico di Buthusmartensikarsch presenta un ritorno di insulto su HNAV1. 4 e Hnav1. 5 canali mentre si mantengono l'attività analgesica[J].Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(44):18270-18280

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