Kit per il test dell'acido nucleico del virus dell'epatite B (Metodo con sonda fluorescente PCR) Per la ricerca

【Nome del prodotto】 Kit per il test dell'acido nucleico del virus dell'epatite B (PCR-Metodo della sonda fluorescente)

【Specifica del pacchetto】48 Test/Kit

Destinazione d'uso

• Il kit è destinato alla determinazione quantitativa del virus dell'epatite B (HBV) acido nucleico (DNA) nei campioni di siero o plasma.
• Viene utilizzato per i pazienti che richiedono test per l'infezione da HBV e quelli sottoposti a terapia antivirale per l'epatite B.
• Progettato per monitorare la risposta al trattamento antivirale e valutare l'efficacia del trattamento tracciando i livelli di DNA dell'HBV nel sangue paziente.
• Tuttavia, Il test non deve essere basato esclusivamente come indicatore della condizione di un paziente.
• Deve essere utilizzato insieme alle manifestazioni cliniche e ad altri test di laboratorio per valutare le condizioni generali del paziente.
• Questo kit non è adatto a scopi di screening del sangue HBV.

Principio della prova

• Il kit impiega perle magnetiche conformazionali sia per lisse che per purificare gli acidi nucleici virali in un tubo di amplificazione PCR standard.
• Il reagente di amplificazione PCR viene quindi aggiunto direttamente allo stesso tubo, consentendo alle perle di partecipare direttamente alla reazione quantitativa fluorescente PCR.
• La tecnologia della sonda Taqman è utilizzata, in cui il 5 '→ 3′ L'attività di esonucleasi dell'acido nucleico della DNA polimerasi Taq degrada la sonda Taqman durante la PCR.
• Questo degrado separa il gruppo reporter fluorescente dal gruppo estinto, Generare un segnale fluorescente.
• Il sistema di rilevamento della PCR fluorescente in tempo reale raccoglie questo segnale in tempo reale, consentendo la determinazione quantitativa del contenuto virale nel campione.
• I campioni di siero clinico contenenti virus dell'epatite B inattivati ​​servono come calibratori e controlli di qualità per il kit.
• Il kit monitora gli inibitori della PCR nel campione rilevando gli standard interni, Mitigare il rischio di falsi negativi.

Componenti

Kit per il test dell'acido nucleico del virus dell'epatite B (Metodo con sonda fluorescente PCR) Per la ricerca
Sarebbe numero	Composizione del prodotto		Componenti principali	Dimensioni e quantità
DLB	Reagenti di estrazione dell'acido nucleico	Lisato di HBV con sfere magnetiche)	Idrossido di sodio, Questa base, Tralatone X-00.tallone magnetico confomatio	5.5mlx 1 bottiglia
DWB		Soluzione di risciacquo HBV	Cloruro di potassio, Tritone X-100	15.0bottiglia ml x l
1	PCR Amplifica il reagente cationico	HBV PCRRReactionSolutim	primer, sonde, deossiribonucleo trifosfato, ioni di magnesio pcr.duffe	1.10mlx 2 tubi
2		Miscela di enzimi HBV	DNA polimerasi e uracile glicosilasi	110μl x 1 tubo
3	Calibrazione Prodotto	Calibratore HBV ①(10-3.0)×10*IUVml	Campione di siero HBV positivo a valore costante (inattivato)	0.35 mlx 1 tubo
4		Calibratore HBV ②(1.0-3.0)×l0IUVml	Campione di siero HBV positivo a valore costante (inattivato)	0.35 ML X I Tube
5		Calibratore HBV ③(1.0-3.0)×10*UI/ml	Campione di siero HBV positivo a valore costante (inattivato)	0.35 ML X L Tubo
6		Calibratore HBV ④(1.0-3.0)×10 I/ml	Campione di siero HBV positivo a valore costante (inattivato)	0.35 mlx 1 tubo
7	Prodotto di controllo di qualità	HBV fortemente positivo C(10-5.0110)×10 I/ml	Campione di siero misto positivo per BV (inattivato)	0.35 ML X L Tubo
8		Controllo di qualità positivo critico HBV (10-100)Uhm	Campione di siero misto positivo per BV (inattivato)	0.35 ML X I Tube
9		Controllo di qualità negativo per HBV	Campione di siero misto HBV negativo (inattivato)	0.35 ML X I Tube
10	Interno etichetta	Etichetta interna HBV	Modello standard interno di acido nucleico	60μl di tubo x L

Appunti: UN. Esistono differenze tra lotto e lotto nei parametri dei calibratori ① A ④ e il valori fissi di QC fortemente positivi e QC positivi critici (tutto all'interno dell'intervallo sopra indicato). Per dettagli, consultare il foglio istruzioni allegato al kit.

1. Non mescolare componenti provenienti da lotti di kit diversi!
2. Porta i tuoi articoli di prova: 0.2ml Provette di reazione per PCR, centrifuga, pipette e puntali di varie dimensioni, E supporto magnetico, e utilizza il nostro supporto magnetico consigliato.

Condizioni di conservazione e data di scadenza

• Kit per l'estrazione degli acidi nucleici, trasportato a temperatura ambiente e conservato a 2-8°C.
• Kit di amplificazione PCR, trasportato a non più in alto di 10 °C, conservato a -20 °C± 5 °C al riparo dalla luce, Evitare
• ripetuti congelamento-scongelamento (non più di 3 volte).
• Data di scadenza: Il kit è valido per 12 mesi, si prega di utilizzarlo entro la data di scadenza. Vedi l'etichetta per i dettagli della data di produzione e della data di scadenza.

Applicabile Strumenti

Da utilizzare con LightCycler® 480, SLAN-96P, Mx3005P, e strumenti per PCR a fluorescenza in tempo reale ABI7500.

Esempio di richiesta

1. Tipo di campione adatto: siero o plasma
2. Raccolta campioni: Questo kit è adatto per campioni di siero o plasma.

Campione di siero: 5 ml di sangue venoso vengono raccolti dal soggetto utilizzando una siringa sterile e posti in una provetta da centrifuga sterile a temperatura ambiente per non più di 6 ore e lasciato precipitare da solo, oppure centrifugato direttamente a 1600g per 5 minuti e il surnatante (facendo attenzione a non aspirare i globuli rossi) viene trasferito in una provetta da centrifuga sterile.

Campione di plasma: 2 ml o 5 ml di sangue venoso vengono raccolti dal soggetto utilizzando una siringa sterile, iniettato in una provetta di raccolta sterile contenente anticoagulante EDTA, misto, e lasciato a temperatura ambiente per non più di 6 ore per consentire al campione di precipitare da solo, oppure direttamente centrifugato a 1600g per 5 minuti per separare il plasma e trasferirlo in una provetta da centrifuga sterile.

3. Magazzinaggio: I campioni da analizzare dopo il trattamento di cui sopra possono essere utilizzati immediatamente per l'analisi, se non in tempo devono essere conservati congelati a una temperatura inferiore a -20°C per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.

4. Trasporto: I campioni devono essere trasportati in una scatola di schiuma con ghiaccio o in una brocca di ghiaccio, allo stato congelato e sigillato.

Metodo di prova

(io) Preparazione dei reagenti (zona di preparazione dei reagenti)

Preparazione del lisato HBV:

1. Mescolare accuratamente il lisato HBV (DLB) contenente perle magnetiche.
2. Rimuovere vari componenti del reagente e consentire loro di equilibrarsi a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
3. Mescola Lisato HBV e HBV Standard interno in un rapporto di 100 µl/persona + 1.0 µl/persona, e mescolare accuratamente.
4. Dispensare immediatamente la miscela in tubi di amplificazione PCR (0.2 provette singole da ml, 0.2 tubi dell'ottetto ml, o piastre PCR da 96 pozzetti) A 100 µl/pozzetto, Garantire che il lisato HBV sia nella parte inferiore del tubo.

Preparazione del reagente di amplificazione PCR:

• Tempo di configurazione: La preparazione del reagente viene condotta dopo che i tubi di estrazione dell'acido nucleico sono stati inseriti nella cremagliera magnetica.
• Preparazione: Basato sui campioni da testare, Preparare il controllo di qualità negativo HBV, Controllo di qualità positivo critico per HBV, HBV forte controllo di qualità positivo, e calibratore dell'HBV.
• Per quantità da ① a ④, Prendi quantità corrispondenti di soluzione di reazione PCR HBV e miscela di enzimi HBV, e mescolare secondo (Soluzione di reazione PCR HBV 43.0 µl/persona + Miscela di enzimi HBV (2.0 µl/persona)), miscelazione accuratamente per formare PCR-mix per uso immediato.

(ii) Purificazione degli acidi nucleici (area di elaborazione dei campioni)

1. Aggiungere 100 μl del campione da testare o controllo di qualità HBV negativo, Controllo di qualità positivo critico per HBV, HBV forte controllo di qualità positivo, Calibratore dell'HBV da ① a ④ nella provetta PCR in cui è stato dispensato il lisato dell'HBV; mescolare delicatamente soffiando 3 A 5 volte; lasciare a temperatura ambiente per 5 A 10 minuti.
2. Trasferire le provette PCR su un supporto magnetico, partire per 2-3 minuti, e aspirare il surnatante usando una pipetta o un dispositivo di pressione negativa, facendo attenzione a non rimuovere le sfere magnetiche.
3. Conservare le provette PCR su un supporto magnetico, aggiungere 250 ml di soluzione di risciacquo HBV (DWB) a ciascun pozzo, partire per 2 minuti e aspirare il supernatante utilizzando una pipetta o un dispositivo a pressione negativa, facendo attenzione a non lasciare residui.

Aggiunta del reagente di amplificazione (area di elaborazione dei campioni)

• Aggiungere 45.0 μl di PCR-Mix in ciascun pozzetto.
• Tappare il tubo e invertitolo.
• Spolegare delicatamente le perle per garantire una miscelazione accurata del mix PCR con le perle.
• Centrifugare istantaneamente il tubo orizzontale.
• Trasferisci i tubi PCR nell'area di rilevamento.
• Posizionarli su uno strumento PCR fluorescente per il rilevamento.

Amplificazione PCR (zona di rilevamento)

Posizionare la provetta di reazione PCR nell'amplificatore, impostare il controllo negativo dell'HBV, Controllo positivo forte per HBV, Controllo positivo critico per HBV, Calibratore HBV da ① a ④ e campione da testare nell'ordine corrispondente, e impostare il nome del campione e la concentrazione del calibratore.

Impostazioni del programma di amplificazione.

SLAN-96P come esempio (LightCycler® 480, SLAN-96P e Mx3005P, ABI7500 hanno la stessa configurazione. Una volta impostato, salvare il file ed eseguire il programma di reazione

Accesso ai risultati

1. Descrizione della curva di amplificazione: La curva di amplificazione è generalmente a forma di S.
2. Impostazione di base: A seconda della situazione sperimentale, come intervallo di impostazione di base è necessario selezionare una sezione con un valore di fluorescenza di fondo stabile.
3. Impostazione della soglia: superare appena il punto più alto della curva di amplificazione del controllo di qualità negativo.
4. Analisi dei risultati: Una volta impostate la linea di base e le linee di soglia, i risultati possono essere analizzati.

Selezionare il canale FAM per ottenere i risultati per il campione da testare e il controllo di qualità; selezionare il canale HEX o VIC per ottenere i risultati per lo standard interno. (Nota: Fare riferimento ai manuali dei diversi strumenti per le impostazioni dettagliate.)

Valori di riferimento

Il limite inferiore di rilevamento e limite di quantificazione per questo kit è 5 UI/ml, determinato da test di ricerca con valori di riferimento ≤40 per Ct target e ≤40 per Ct standard interno.

Giudizio sulla validità dell'esperimento

1. I calibratori erano tutti positivi e avevano un coefficiente di correlazione lineare|R|≥0,980.
2. Un controllo di qualità negativo dovrebbe essere non rilevabile e avere un valore Ct dello standard interno ≤ 40.
3. I controlli fortemente positivi hanno un valore Ct <25 e un intervallo di quantificazione di (1.0-5.0) X 105 UI/ml i controlli criticamente positivi hanno un valore Ct <38 e un intervallo di quantificazione di (10- 100) UI/ml. I requisiti di cui sopra devono essere soddisfatti nello stesso esperimento, Altrimenti, i risultati del test sono considerati non validi e devono essere rieseguiti.

Interpretazione dei risultati dei test

1. Se il risultato del campione è 5-2.0 X 109 UI/ml e la curva di amplificazione mostra una forma a S, mentre il valore Ct del campione è ≤40 e il valore Ct dello standard interno è ≤40, il risultato viene giudicato valido e i valori positivi e di concentrazione corrispondenti possono essere riportati direttamente.
2. Se il risultato del campione è >2.0 X 109 UI/ml e la curva di amplificazione mostra una forma a S, il campione Il valore Ct è ≤40, e il valore Ct dello standard interno è ≤40, può essere riportato direttamente come HBV DNA >2.0 X 109 UI/ml. Se è necessaria una quantificazione precisa, il campione può essere diluito al di sotto 2.0 X 109 UI/ml e ritestato
3. Se il risultato del campione è HBV DNA <5UI/ml, il valore Ct del campione è ≤40 e il valore Ct dello standard interno è ≤40, il risultato viene riportato come concentrazione di HBV DNA inferiore al limite inferiore di rilevamento del kit; se lo standard interno è anormale (Ct >40 o nessun valore), il risultato del campione non è valido e la causa deve essere trovata ed esclusa e il campione deve essere ripetuto (se il risultato del test ripetuto è ancora non valido, Ci contatti per favore). (se il risultato della ripetizione del test non è ancora valido, Ci contatti per favore).