Metodo CTAB Kit di estrazione del DNA genomico vegetale su piccola scala

1. Componenti del kit di reagenti

Specifiche	50T	100T
Gatto. NO.	SN0201	SN0202
Colonne di estrazione del DNA (impostato)	50 (impostato)	100 (impostato)
Soluzione tampone reagente A	30 ml	2 × 30 ml
Soluzione tampone reagente C	30 ml	2 × 30 ml
Tampone di lavaggio 1	15 ml	2 × 15 ml
RNasi A	1ml	1ml
Tampone di eluizione	20 ml	20 ml
Manuale di istruzioni	1	1

2. Magazzinaggio

Questo kit deve essere conservato a temperatura ambiente (15-25℃) in condizioni asciutte e può essere conservato per 12 mesi. Le colonne di purificazione per l'estrazione del DNA possono essere conservate in un ambiente fresco e asciutto per un massimo di 1 anno. La RNasi A contiene un conservante e può essere trasportata a temperatura ambiente, ma per la conservazione a lungo termine, dovrebbe essere mantenuto a -20 ℃.

3. Istruzioni per l'uso del kit di reagenti

3.1 Questo kit è destinato a scopi di ricerca in biologia molecolare e non deve essere utilizzato per la diagnosi o il trattamento di malattie.

3.2 Alcuni componenti del kit contengono sostanze irritanti; è opportuno prendere le dovute precauzioni (come indossare indumenti protettivi e occhiali protettivi).

3.3 L'utilizzo di questo kit richiede apparecchiature aggiuntive come una centrifuga ad alta velocità, bagnomaria (bagno di metallo), miscelatore a vortice, etanolo anidro, azoto liquido, cloroformio, acqua deionizzata sterile, e tubi EP.

4. Introduzione al kit di reagenti

IL CTAB-Pianta basata Purificazione del DNA Il kit fornisce un metodo CTAB migliorato per purificare il DNA, utilizzando un tampone di legame specifico che precipita in modo efficiente il DNA, e successivamente raccoglie il DNA ad elevata purezza attraverso una colonna di adsorbimento.

 

Questo kit è ampiamente utilizzato per tessuti vegetali e funghi, in grado di estrarre il DNA totale dai campioni all'interno 2 ore (compreso il DNA mitocondriale e il DNA dei cloroplasti). Il DNA estratto può essere utilizzato direttamente per esperimenti a valle come PCR, Southernblotting, e altri.

5. Principi e procedure sperimentali

6. Processo di estrazione

Precauzioni prima di iniziare l'esperimento:

 

1. Tamponi reagente A e C può precipitare in condizioni di bassa temperatura. Si consiglia di riscaldare a 65°C per 5 minuti e utilizzare dopo che i precipitati si sono sciolti.
2. LavareRespingente 1 dovrebbe essere aggiunta la quantità specificata di etanolo anidro come indicato sull'etichetta della bottiglia. Contrassegnare l'etichetta una volta aggiunto l'etanolo.
3. Il tampone di eluizione è a 0.1x soluzione TEcontenente una quantità minima di EDTA. Se l'EDTA influisce sugli esperimenti successivi, Si consiglia acqua deionizzata sterile come sostituto del tampone di eluizione.

 

1. Gestione dei campioni:
2. Raccolta e stoccaggio dei materiali:

Materiale appena raccolto, se non utilizzato immediatamente, devono essere posti in azoto liquido e infine conservati a -80°C. I materiali essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente.

1. Se possibile, raccogliere materiale fresco poiché contiene meno polisaccaridi e polifenoli.
2. Quando si raccolgono funghi dalla coltura liquida, separare il liquido mediante centrifugazione e raccogliere i corpi fungini.
3. Macinare in giro 100 mg di campioni freschi o non più di 20 mg di materiale secco utilizzando azoto liquido.

(Nota: Quantità di campione diverse possono richiedere l'ottimizzazione attraverso esperimenti preliminari prima dell'uso.)

3. Aggiungere 550 μl di tampone reagente A e 10 µl di RNasi A (10 mg/ml) per garantire che non vi siano grumi di tessuto nel campione macinato. I grumi di tessuto sono difficili da lisare e possono ridurre la resa del DNA. Non mescolare tampone reagente A e RNasi Aprima dell'uso.
4. Incubare a 65°C per 20-30 minuti, capovolgere delicatamente 2-3 volte. Questo passaggio è per la lisi cellulare.
5. Centrifugare il lisato 5 minuti a 14,000 giri/min (20,000× g).

(Nota: Alcuni materiali vegetali potrebbero contenere molte sostanze appiccicose in questa fase, che può tagliare il DNA nelle fasi successive. Idealmente, rimuovere queste sostanze trasferendo il surnatante in una nuova provetta da centrifuga dopo la centrifugazione.)

6. Trasferire con attenzione il liquido ottenuto nella fase precedente in una nuova provetta da centrifuga.

(Nota: Circa 500 È possibile trasferire μl di liquido; per alcune specie, potrebbe essere inferiore a 500 ml.)

7. Aggiungere un volume uguale di cloroformio al lisato e capovolgere delicatamente per mescolare.

(Nota: Per esempio, aggiungere 500 μl di cloroformio se ne hai 500 ml di lisato. Se il volume del lisato è inferiore a 500 ml, regolare di conseguenza il volume del cloroformio.)

8. Centrifugare a 12,000 giri al minuto per 10 minuti.
9. Trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta da centrifuga (circa 500 ml).
10. Aggiungere un volume uguale di tampone reagente C e un volume uguale di etanolo anidro nel lisato, e mescolare.

(Per esempio, se aggiungi 450 μl di tampone reagente C, quindi aggiungi 450 ml di etanolo anidro. Se il volume del lisato è inferiore a 450 ml, ridurre proporzionalmente la quantità di tampone reagente C. Si verificherà una certa precipitazione dopo l'aggiunta del tampone reagente C, ma non influenzerà gli esperimenti successivi.)

11. Trasferire il liquido ottenuto su una colonna di purificazione del DNA (kit), circa 650-700 ml ogni volta. Centrifugare al massimo 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti raccolti, e reinserire il tubo di raccolta nella colonna di purificazione per il passaggio successivo.
12. Ripeti il ​​passaggio 11, aggiungendo il liquido rimanente alla colonna di purificazione del DNA (kit) e centrifugare a fine cottura 8,000 giri al minuto per 1 minuto. Eliminare i rifiuti e il tubo di raccolta.
13. Posizionare la colonna di purificazione del DNA (kit) in una nuova provetta di raccolta, aggiungere 300 ml di Lavare Respingente 1, centrifugare al massimo 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti, e reinserire la colonna di purificazione del DNA (kit) nel tubo per il passaggio successivo.

(Nota: Assicurarsi che sia stato aggiunto etanolo anidro Lavare Respingente 1.)

14. Aggiungere 500 ml di tampone di risciacquo 1 alla colonna di purificazione del DNA (kit), centrifugare a 14,000 giri/min (20,000× g) per 2 minuti, prolungare leggermente il tempo di centrifugazione per una membrana più asciutta.
15. Posizionare la colonna di purificazione del DNA (kit) in una nuova provetta da centrifuga, aprire, e scaldare a 65°C per 2 minuti. Questo passaggio può essere prolungato per evaporare il più possibile l'etanolo per evitare che l'etanolo residuo influisca sugli esperimenti a valle.
16. Gocciolare 100 ml di tampone di eluizionesulla membrana, centrifugare a 12,000 giri al minuto per 2 minuti.

(Nota: 1. Eluizione del DNA con 50 μl di tampone di eluizione può aumentare la concentrazione del DNA ma diminuire la resa totale del DNA. 2. L'eluato può essere riapplicato alla colonna di purificazione del DNA per una seconda eluizione, centrifugare a 12,000 giri al minuto per 2 minuti per raccogliere, che può migliorare la resa del DNA.)