Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) merupakan komponen penting dari reaksi berantai polimerase (PCR). dNTP berfungsi sebagai bahan penyusun yang memungkinkan terjadinya replikasi DNA. Selama PCR, dNTP memungkinkan amplifikasi urutan DNA target. Memahami apa itu dNTP dan fungsinya adalah kunci untuk mengapresiasi PCR.
Apa Kepanjangan dari dNTP?
dNTP adalah singkatan dari deoksiribonukleotida trifosfat. Deoksiribonukleotida adalah monomer yang menyusun DNA. Setiap deoksiribonukleotida terdiri dari:
- Basa nitrogen: adenin (A), timin (T), sitosin (C), atau guanin (G).
- Molekul gula deoksiribosa.
- Gugus trifosfat.
'Deoksi’ awalan menunjukkan bahwa komponen gula adalah deoksiribosa, bukan ribosa. Deoksiribosa kekurangan atom oksigen pada 2′ karbon.
Trifosfat mengacu pada tiga fosfat yang melekat pada 5′ karbon pada gula. Memiliki tiga gugus fosfat membuat dNTP menjadi molekul berenergi tinggi.
Berapa banyak jenis dNTP?
Ada empat dNTP yang berbeda, satu untuk setiap basis DNA:
- dATP – deoksiadenosin trifosfat
- dTTP –deoksitimidin trifosfat
- DCTP –deoksisitidin trifosfat
- dGTP –deoksiguanosin trifosfat
Keempat dNTP ini adalah bahan dasar yang diperlukan untuk mensintesis untaian DNA baru.
Apa itu dNTP dalam Biologi?
Dalam biologi, dNTP memiliki peran sentral dalam replikasi DNA dan PCR:
Replikasi DNA
Selama replikasi DNA di dalam sel, dNTP dimasukkan ke dalam untaian DNA baru saat disintesis. Heliks DNA beruntai ganda terlepas dan terbelah menjadi dua untai tunggal. Setiap helai bertindak sebagai cetakan untuk membuat untai komplementer baru.
DNA polimerase menambahkan dNTP yang melengkapi untai cetakan, mengikat melalui pasangan basa. Saat pangkalan berpasangan, tulang punggung gula-fosfat dari dNTP dihubungkan bersama.
Hal ini berlanjut hingga kedua untai baru merupakan salinan lengkap dari molekul DNA asli. dNTP menyediakan komponen yang diperlukan untuk membangun untaian DNA baru.
Reaksi Berantai Polimerase
Di PCR, dNTP melakukan fungsi yang sama seperti selama replikasi DNA. PCR meniru replikasi DNA seluler dalam tabung reaksi. Urutan DNA target disalin berulang kali menggunakan siklus pemanasan dan pendinginan.
Di setiap siklus, dNTP ditambahkan oleh DNA polimerase untuk membangun untaian baru yang melengkapi untaian cetakan yang terpisah. Hal ini memperkuat wilayah target secara eksponensial. DNTP memungkinkan sintesis cepat miliaran salinan segmen DNA.
PCR tidak dapat dilanjutkan tanpa dNTP untuk mempolimerisasi untaian DNA baru.
Bagaimana cara kerja dNTP di PCR?
dNTP adalah reagen penting yang memungkinkan amplifikasi PCR. Berikut ini ikhtisar bagaimana dNTP berfungsi di setiap langkah PCR:
Denaturasi
Pada tahap denaturasi awal, DNA beruntai ganda dipanaskan hingga 94-98°C. Ikatan hidrogen antara untaian komplementer putus, menghasilkan dua molekul DNA beruntai tunggal.
anil
Suhu reaksi diturunkan menjadi 50-65°C untuk memungkinkan anil primer. Primer maju dan mundur berikatan dengan rangkaian komplementer yang mengapit wilayah DNA target.
Perpanjangan/Elongasi
Pada langkah ini, DNA polimerase menambahkan dNTP ke primer, mensintesis untaian baru yang melengkapi untaian templat. Suhu dinaikkan menjadi 72°C, suhu ideal untuk Taq polimerase aktivitas enzim.
Taq polimerase membawa dNTP ke pasangan basa dengan basis templat yang terbuka. Saat setiap dNTP ditambahkan, ikatan fosfodiester terbentuk antara itu dan untai DNA yang sedang tumbuh.
Hal ini berlanjut hingga rangkaian komplementer lengkap terbentuk. Hasilnya adalah dua salinan DNA beruntai ganda baru yang berisi wilayah target.
Pengulangan
Siklus termal berulang – pemanasan untuk memisahkan untaian, pendinginan untuk anil primer, dan ekstensi yang dimediasi polimerase menggunakan dNTP.
Setiap siklus menggandakan jumlah salinan DNA. Setelah 30-40 siklus, jutaan salinan dari target dibuat.
DNTP yang ditambahkan di setiap fase ekstensi memungkinkan amplifikasi eksponensial. Tanpa dNTP, untaian DNA baru tidak dapat disintesis.
Apa yang Terjadi jika dNTP Tidak Diikutsertakan dalam PCR?
dNTP sangat penting dan diperlukan untuk PCR. Jika dNTP tidak ditambahkan ke campuran master PCR, reaksinya akan gagal.
Tanpa dNTP, Taq polimerase tidak memiliki nukleotida untuk ditambahkan ke primer. Karena itu, pemanjangan untaian DNA baru tidak dapat terjadi. DNA target tidak akan diperkuat sama sekali.
Jika dNTP tidak disertakan, berarti PCR tidak akan berfungsi, periode. Hanya DNA primer dan templat yang tersisa tanpa amplifikasi.
Reaksi kontrol yang tidak memiliki dNTP dapat berguna untuk memastikan bahwa sintesis DNA bergantung pada dNTP. Tapi biasanya, kelalaian total terhadap dNTP merupakan eksperimen PCR otomatis yang gagal.
Mengapa ddNTPs Digunakan dalam Pengurutan DNA?
Dalam reaksi sekuensing DNA, deoksinukleotida yang sedikit dimodifikasi disebut dideoksinukleotida (ddNTP) digunakan. ddNTP berbeda dengan mengandung atom hidrogen pada 3′ karbon dibandingkan gugus hidroksil.
ini 3′ hidrogen mencegah pembentukan ikatan fosfodiester berikutnya. Ketika ddNTP digabungkan oleh DNA polimerase, ekstensi untai dihentikan.
Dengan menggunakan rasio dNTPs dan ddNTPs, penghentian acak terjadi, menghasilkan fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Ini kemudian dapat dipisahkan berdasarkan ukuran untuk merekonstruksi urutan aslinya.
ddNTP memungkinkan pengurutan DNA dengan menghentikan sintesis secara tiba-tiba pada basa tertentu. Dibandingkan dengan dNTP normal, ddNTP tidak memiliki 3′ gugus hidroksil diperlukan untuk melanjutkan pemanjangan untai.
Berapa Konsentrasi dNTP Khas di PCR?
Konsentrasi dNTP standar dalam PCR umumnya 200 μM dari setiap dNTP. Ini memberikan rasio dNTP dan templat DNA yang optimal untuk amplifikasi yang efisien.
Tingkat dNTP yang terlalu rendah dapat menyebabkan amplifikasi yang tidak spesifik dan hasil yang tidak mencukupi. Terlalu tinggi dapat mengurangi akurasi dan meningkatkan produk yang tidak spesifik.
200 μM untuk dNTP, untuk total 800 μM dNTP, cocok untuk sebagian besar aplikasi PCR. Kurang lebih dapat digunakan jika diperlukan untuk mengoptimalkan reaksi.
Untuk PCR yang panjang, konsentrasi dNTP yang lebih tinggi (500-1000 μM) dapat meningkatkan hasil untuk memperkuat target DNA yang lebih panjang.
Penting untuk menjaga keempat dNTP berada pada konsentrasi yang sama. Rasio yang tidak seimbang dapat menghambat reaksi.
Kesimpulan
dNTP adalah blok pembangun nukleotida yang memungkinkan terjadinya amplifikasi PCR. Komponen-komponen ini termasuk dATP, dTTP, DCTP, dan dGTP.
Pada setiap siklus PCR, dNTP digabungkan oleh Taq polimerase ke dalam untaian DNA baru yang melengkapi untaian templat. Hal ini memungkinkan penggandaan eksponensial pada wilayah DNA target.
dNTP adalah reagen penting untuk PCR. Tanpa dNTP, DNA polimerase tidak dapat mensintesis salinan baru dari urutan target. Amplifikasi bergantung sepenuhnya pada kehadiran keempat dNTP.
Memahami peran dNTP membantu kita memahami bagaimana PCR berhasil menghasilkan miliaran salinan segmen DNA dalam hitungan jam. Dengan menyediakan substrat dasar untuk replikasi DNA, dNTP merupakan inti dari teknik biologi molekuler yang sangat diperlukan ini.
