Trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) son componentes esenciales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los dNTP sirven como componentes básicos que permiten que se produzca la replicación del ADN.. Durante PCR, Los dNTP permiten la amplificación de secuencias de ADN diana. Comprender qué son los dNTP y su función es clave para apreciar la PCR.
¿Qué significa dNTP??
dNTP significa trifosfato de desoxirribonucleótido. Los desoxirribonucleótidos son los monómeros que componen el ADN.. Cada desoxirribonucleótido está compuesto por:
- una base nitrogenada: adenina (A), timina (t), citosina (C), o guanina (GRAMO).
- Una molécula de azúcar desoxirribosa..
- Un grupo trifosfato.
El 'desoxi’ El prefijo indica que el componente del azúcar es desoxirribosa en lugar de ribosa.. La desoxirribosa carece de un átomo de oxígeno en el 2′ carbón.
El trifosfato se refiere a los tres fosfatos unidos a los 5′ carbono en el azúcar. Tener tres grupos fosfato convierte a los dNTP en moléculas de alta energía.
¿Cuántos tipos de dNTP??
Hay cuatro dNTP diferentes, uno para cada una de las bases del ADN:
- dATP – trifosfato de desoxiadenosina
- dTTP –trifosfato de desoxitimidina
- DCTP –trifosfato de desoxicitidina
- dGTP –trifosfato de desoxiguanosina
Estos cuatro dNTP son los componentes básicos necesarios para sintetizar nuevas cadenas de ADN..
¿Qué son los dNTP en biología??
en biología, Los dNTP tienen un papel central en la replicación del ADN y la PCR.:
Replicación del ADN
Durante la replicación del ADN dentro de las células., Los dNTP se incorporan a nuevas cadenas de ADN a medida que se sintetizan.. La hélice de ADN de doble hebra se desenrolla y se divide en dos hebras simples.. Cada hebra actúa como plantilla para que se forme una nueva hebra complementaria..
La ADN polimerasa agrega dNTP que son complementarios a la cadena plantilla, unión mediante emparejamiento de bases. Mientras las bases se emparejan, Las cadenas principales de azúcar-fosfato de los dNTP están unidas entre sí..
Esto continúa hasta que ambas cadenas nuevas sean copias completas de la molécula de ADN original.. Los dNTP proporcionan los componentes necesarios para construir las nuevas cadenas de ADN..
Reacción en cadena de la polimerasa
En PCR, Los dNTP realizan la misma función que durante la replicación del ADN.. La PCR imita la replicación del ADN celular en un tubo de ensayo. La secuencia de ADN objetivo se copia repetidamente mediante ciclos de calentamiento y enfriamiento..
en cada ciclo, La ADN polimerasa agrega dNTP para construir nuevas cadenas complementarias a las cadenas plantilla separadas.. Esto amplifica exponencialmente la región objetivo.. Los dNTP permiten la síntesis rápida de miles de millones de copias del segmento de ADN.
La PCR no podría realizarse sin dNTP para polimerizar nuevas cadenas de ADN.
¿Cómo funcionan los dNTP en PCR??
Los dNTP son un reactivo esencial que permite la amplificación por PCR. A continuación se ofrece una descripción general de cómo funcionan los dNTP en cada paso de la PCR.:
Desnaturalización
En el paso inicial de desnaturalización, El ADN bicatenario se calienta hasta 94-98°C.. Los enlaces de hidrógeno entre las hebras complementarias se rompen., produciendo dos moléculas de ADN monocatenario.
Recocido
La temperatura de reacción se reduce a 50-65°C para permitir el recocido del cebador.. Los cebadores directos e inversos se unen a secuencias complementarias que flanquean la región de ADN objetivo.
Extensión/Elongación
en este paso, La ADN polimerasa agrega dNTP a los cebadores, sintetizar nuevas hebras complementarias a las hebras plantilla. La temperatura se eleva a 72°C., la temperatura ideal para polimerasa taq actividad enzimática.
La Taq polimerasa lleva los dNTP al par de bases con las bases modelo expuestas.. A medida que se agrega cada dNTP, Se forma un enlace fosfodiéster entre él y la cadena de ADN en crecimiento..
Esto continúa hasta que se forma la secuencia complementaria completa.. El resultado son dos nuevas copias de ADN bicatenario que contienen la región objetivo..
Repetición
El ciclo térmico se repite – calentamiento para separar las hebras, enfriamiento para recocido de imprimación, y extensión mediada por polimerasa utilizando dNTP.
Cada ciclo duplica el número de copias de ADN.. Después 30-40 ciclos, Se hacen millones de copias del objetivo..
Los dNTP añadidos en cada fase de extensión permiten la amplificación exponencial. Sin dNTP, No se pudieron sintetizar nuevas cadenas de ADN..
¿Qué sucede si los dNTP quedan fuera de la PCR??
Los dNTP son esenciales y necesarios para la PCR. Si no se agregan dNTP a la mezcla maestra de PCR, la reacción fallará.
Sin dNTP, La polimerasa Taq no tiene nucleótidos para agregar a los cebadores.. Por lo tanto, La elongación de nuevas cadenas de ADN no puede ocurrir.. El ADN objetivo no se amplificará en absoluto..
Dejar de lado los dNTP significa que la PCR no funcionará, período. Sólo quedarán los cebadores y el ADN molde sin amplificación..
Una reacción de control que carece de dNTP puede ser útil para confirmar que la síntesis de ADN depende de los dNTP.. Pero normalmente, la omisión total de los dNTP es un experimento de PCR fallido automático.
¿Por qué se utilizan los ddNTP en la secuenciación de ADN??
En reacciones de secuenciación de ADN., desoxinucleótidos ligeramente modificados llamados didesoxinucleótidos (ddNTP) son usados. Los ddNTP se diferencian por contener un átomo de hidrógeno en el 3′ carbono en lugar de un grupo hidroxilo.
este 3′ El hidrógeno impide la formación del siguiente enlace fosfodiéster.. Cuando un ddNTP es incorporado por la ADN polimerasa, la extensión de la hebra ha terminado.
Utilizando una proporción de dNTP y ddNTP, se produce una terminación aleatoria, Generando fragmentos de ADN de diferentes longitudes.. Luego se pueden separar por tamaño para reconstruir la secuencia original..
Los ddNTP permiten la secuenciación del ADN al detener abruptamente la síntesis en bases específicas. En comparación con los dNTP normales, Los ddNTP carecen de los 3′ grupo hidroxilo necesario para continuar el alargamiento de la hebra.
¿Cuál es la concentración típica de dNTP en PCR??
La concentración estándar de dNTP en una PCR generalmente es 200 μM de cada dNTP. Esto proporciona una proporción óptima de dNTP a plantillas de ADN para una amplificación eficiente..
Un nivel demasiado bajo de dNTP puede provocar una amplificación no específica y rendimientos insuficientes. Demasiado alto puede reducir la precisión y aumentar los productos no específicos..
200 μM para dNTP, por un total de 800 mM dNTP, Es adecuado para la mayoría de aplicaciones de PCR.. Se puede usar más o menos si es necesario para optimizar la reacción..
Para PCR largas, una mayor concentración de dNTP (500-1000 µM) puede mejorar los rendimientos para amplificar objetivos de ADN más largos.
Es importante mantener los cuatro dNTP presentes en concentraciones iguales. Una proporción desequilibrada puede dificultar la reacción..
Conclusión
Los dNTP son los componentes básicos de nucleótidos que permiten que se produzca la amplificación por PCR.. Estos componentes incluyen dATP, dTTP, DCTP, y dGTP.
En cada ciclo de PCR, La Taq polimerasa incorpora los dNTP en nuevas cadenas de ADN complementarias a las cadenas plantilla.. Esto permite duplicar exponencialmente la región de ADN objetivo..
Los dNTP son reactivos esenciales para la PCR. Sin dNTP, La ADN polimerasa no puede sintetizar nuevas copias de la secuencia objetivo.. La amplificación depende completamente de la presencia de los cuatro dNTP..
Comprender el papel de los dNTP nos ayuda a apreciar cómo la PCR logra producir miles de millones de copias de segmentos de ADN en cuestión de horas.. Al proporcionar los sustratos básicos para la replicación del ADN., Los dNTP son el núcleo de esta indispensable técnica de biología molecular.
