Kit Ekstraksi DNA Genomik Kotoran atau Tanah

1. Komponen kit reagen

2. Penyimpanan

Kit reagen ini harus disimpan pada suhu kamar (15-25℃) dan dalam kondisi kering, dengan umur simpan 12 bulan. Kolom pemurnian ekstraksi DNA dapat disimpan 1 tahun di lingkungan sejuk dan kering. Lisozim, Proteinase K, Dan RNase A mengandung bahan pengawet, memungkinkan transportasi pada suhu kamar, tapi untuk penyimpanan jangka panjang, mereka harus disimpan pada -20℃.

3. Petunjuk Penggunaan Kit Reagen

3.1 Kit reagen ini ditujukan untuk penelitian biologi molekuler dan tidak boleh digunakan untuk diagnosis atau pengobatan penyakit.

3.2 Beberapa komponen dalam kit reagen mengandung bahan iritan. Tindakan perlindungan seperti mengenakan pakaian pelindung dan kacamata direkomendasikan.

3.3 Selama penggunaan kit reagen ini, mesin sentrifugal berkecepatan tinggi, mandi air (mandi logam), pencampur pusaran, etanol anhidrat, air deionisasi steril, dan tabung EP perlu disiapkan oleh pengguna.

4. Pengantar Kit Reagen

Kit ini memberikan metode yang cepat dan efisien untuk memurnikan DNA genomik mikroba dari tanah, kotoran, dan sampel muntah. Ini banyak digunakan untuk ekstraksi DNA mikroba dari tanah, kotoran, dan muntah.

Kit ini secara efektif menghilangkan kotoran dan inhibitor sampel, mengurangi reaksi penghambatan dalam percobaan hilir seperti PCR. Seluruh proses pemurnian tidak memerlukan reagen beracun seperti fenol-kloroform. DNA yang diekstraksi dapat langsung digunakan untuk PCR, Blot Selatan, dan aplikasi lainnya.

5. Prinsip dan Prosedur Eksperimental

6. Proses Ekstraksi

Sebelum Memulai Eksperimen:

A. Buffer reagen Iv dapat mengendap pada kondisi suhu rendah. Kami merekomendasikan pemanasan di 65 ℃ untuk 5 menit. Setelah endapan larut, itu bisa digunakan secara normal.

B. Sebelum digunakan, Tambahkan jumlah etanol anhidrat yang ditentukan Cuci Buffer 1 seperti yang ditunjukkan pada label botol. Tandai cek pada label untuk menunjukkan penambahan etanol anhidrat.

C. Buffer Elusi adalah a 0.1x solusi TE mengandung jumlah minimal EDTA. Jika EDTA mungkin mempengaruhi percobaan selanjutnya, Dianjurkan untuk mengganti buffer elusi dengan air deionisasi steril.

1. Pemrosesan Sampel (Penghapusan inhibitor):

A. Sampel tinja dan muntah: Tambahkan sekitar 200mg sampel yang akan diekstraksi, menambahkan 1ml reagen penghilangan asam humic i, Vortex untuk 1-2 menit, sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit, buang supernatannya, menambahkan 560μl buffer IV ke pelet, Balik dan aduk rata, dicerna di 85 ℃ untuk 5 menit, balikkan dan campur 6-7 kali selama pencernaan, lalu lanjutkan ke melangkah 2.

B. Sampel tanah: Beratnya sekitar 0,1g-0.5g tanah yang diayak, menambahkan 500μl buffer IV dan 100μl reagen penghilangan asam humat, Balik dan aduk rata, dicerna di 85 ℃ untuk 5 menit, balikkan dan campur 6-7 kali selama pencernaan, lalu lanjutkan ke melangkah 2.

(Catatan: Reagen penghilangan asam humic reagen penghilangan asam humic reagen ii terutama digunakan untuk tanah dengan kandungan asam humat tinggi, seperti tanah hutan dan tanah sedimen. Menambahkan 1ml reagen penghilangan asam humic i ke sampel, pusaran, goyang 1-2 menit, sentrifugasi di 8,000 rpm untuk 2 menit, buang supernatannya, lalu tambahkan 1ml reagen penghilangan asam humat II, pusaran, sentrifugasi di 8,000 rpm untuk 2 menit, buang supernatannya. Langkah ini selanjutnya dapat mengurangi inhibitor asam humat tanah tetapi secara signifikan mengurangi hasil DNA.)

2. Sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit, pindahkan supernatan ke tabung centrifuge baru (sekitar 500μl cairan ditransfer), Tambahkan 20μl proteinase k (10 mg/ml), 20μl lisozim, dan 20μl rnase a, dan diinkubasi di 65 ℃ untuk 2 menit.
3. Tambahkan volume yang sama Reagen Buffer C Plus (sekitar 560μl cairan ditransfer) ke lisat, campur dengan baik. Jika muncul endapan putih, Biarkan tenang; itu tidak akan mempengaruhi percobaan selanjutnya setelah endapan menghilang.
4. Tambahkan volume etanol yang sama ke Reagen Buffer C Plus (misalnya, menambahkan 560μl dari Reagen Buffer C Plus, Kemudian tambahkan 560μl etanol), campur dengan baik. Mungkin ada presipitasi, namun hal ini tidak akan memengaruhi eksperimen selanjutnya.
5. Tambahkan cairan yang diperoleh ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (lengan baju) (sekitar 650-700μl setiap kali), centrifuge di atas 8,000 rpm untuk 1 menit, Buang cairan limbah yang dikumpulkan, dan memasukkan kembali tabung pengumpulan ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (lengan baju) untuk langkah selanjutnya.
6. Menambahkan 400buffer penghapusan penghambat μl, centrifuge di atas 8,000 rpm untuk 1 menit, Buang cairan limbah, dan memasukkan kembali pemurnian DNA kolom ke dalam lengan untuk langkah berikutnya.
7. Menambahkan 500μl buffer cuci 1 ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (lengan baju), sentrifugasi di 14,000 rpm (20,000×g) untuk 1 menit.
8. Menambahkan 300μl buffer cuci 1 lagi ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (lengan baju), sentrifugasi di 14,000 rpm (20,000×g) untuk 2 menit.
9. Tempatkan kolom pemurnian ekstraksi DNA (lengan baju) ke dalam tabung centrifuge yang baru, Buka tutupnya, dan diinkubasi di 65 ℃ untuk 2 menit. Langkah ini dapat diperpanjang jika perlu untuk menguap etanol sebanyak mungkin untuk mencegah residu etanol mempengaruhi eksperimen hilir.
10. Menetes 100μl buffer elusi ke membran, sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit.

(Catatan: 1. Eluting DNA dengan buffer elusi 50μL dapat meningkatkan konsentrasi DNA tetapi mengurangi hasil DNA total; 2. DNA yang dielusi dapat diterapkan kembali ke kolom pemurnian ekstraksi DNA, disentrifugasi lagi di 12,000 rpm untuk 2 menit, dan dikumpulkan untuk meningkatkan hasil DNA.)