Solarbio kreatin kinaza (Ck) Kit za ispitivanje aktivnosti

Kreatin kinaza (Ck) Kit za ispitivanje aktivnosti

Bilješka: Uzmite dva ili tri različita uzorka za predviđanje prije testa.

Operativna oprema: Spektrofotometar

Mačka ne: BC1140

Veličina:50T/48s

Komponente:

Otopina ekstrakta: 60 mL ×1. Skladištenje na 4 ℃.

Reagens i: prah × 1, čuvati na tamnom mjestu na -20 ℃. Otopljen u 10 ML destilirane vode prije upotrebe, neiskorišteni reagens mora se pohraniti na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.

Reagens II: prah × 1, čuvati na -20℃. Otopljen u 0.5 ML destilirane vode prije upotrebe, neiskorišteni reagens mora se pohraniti na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.

Reagens iii: prah × 2, čuvati na -20℃. Otopljen u 0.5 ML destilirane vode prije upotrebe, reagensi koji se ne mogu potrošiti pohranjuju se na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.

Reagens IV: prah × 1, čuvati na -20℃. Otopljen u 0.65 ML destilirane vode prije upotrebe, neiskorišteni reagens mora se pohraniti na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.

Reagens v: 15 mL ×1. Skladištenje na 4 ℃.

 

Opis proizvoda:

Kreatin kinaza (Ck) (EC 2.7.3.2) je također poznat kao kreatin fosfokinaza, koji uglavnom postoji u srcu, mišića, i mozak. Može reverzibilno katalizirati trans-fosfornu reakciju između kreatina i ATP-a. To je važna kinaza izravno povezana s prijenosom stanične energije, kontrakcija mišića i regeneracija ATP-a.

CK katalizira kreatin fosfat i ADP za stvaranje kreatina i ATP, heksokinaza katalizira ATP i glukozu za stvaranje glukoza-6-fosfata, a glukoza-6-fosfat dehidrogenaza katalizira glukozu-6- fosfata i NADP+ za stvaranje NADPH, što rezultira povećanjem 340 nm vrijednost apsorpcije svjetlosti, koji se koristi za izražavanje aktivnosti enzima CK.

Potrebni reagensi i oprema, ali nisu pruženi

Vage, niskotemperaturna centrifuga, Stalna temperaturna vodena kupka, spektrofotometar, 1 mL kvarcne kivete i destilirane vode.

Postupak

Ja. Ekstrakcija otopine sirovog enzima:

1. 1. Uzorak tkiva:

Udio mase tkiva (g): volumen otopine ekstrakta (ml): 1:5~ 10 (preporuča se izvagati oko 0.1 g tkiva, dodati 1 ML otopine ekstrakta) za homogenost ledene kupke. Centrifuga na 10000 × g za 15 minuta na 4 ℃, uzmite supernatant i stavite ga na led za ispitivanje.

2. Uzorak seruma:

Izravno određivanje.

3. Uzorak stanica:

Broj ćelija (104): volumen otopine ekstrakta(ml) je 500~1000:1 (1 Preporučuje se dodavanje mL otopine ekstrakta 5 milijun stanica), dodaje se otopina ekstrakta, a stanice se razbijaju ultrazvučnim valovima u ledenoj kupelji (Vlast: 300W, ultrazvučni: 3s, interval: 7s, ukupno vrijeme: 3 minuta). Centrifuga na, 10000× g za 10 minuta na 4 ℃, supernatant i stavite ga na led za ispitivanje.

Ii. Test postupak:

1. Zagrijte spektrofotometar više od 30 minuta, Podesite valnu duljinu na 340 NM, i namjestiti na nulu destiliranom vodom.
2. Radno rješenje: pomiješajte reagens I, Reagens II, Reagens iii, Reagens IV i Reagens V u omjeru 70:4:7:10:90 (omjer volumena) Prije upotrebe. Pripremite kada će se otopina koristiti. Inkubirati za 20 minuta na sobnoj temperaturi prije upotrebe (ovaj korak se ne može izostaviti).
3. Operativna tablica: dodajte sljedeće reagense 1 mL kiveta

Ime reagensa (μL)	Prazna cijev (Ab)	Epruveta (NA)
otopina sirovog enzima	–	200
Radno rješenje	450	450
Destilirana voda	550	350
Dodajte gornje reagense u 1 ML kvarcna kiveta, dobro ih promiješajte i izmjerite vrijednost apsorbancije A1 na 340 nm za 10 s, brzo ih stavite u vodenu kupelj na 37 ℃ 3 minuta (čitač mikropločica s kontroliranom temperaturom može se postaviti na 37 ℃), izvadite vrijednost apsorbancije A2 na 190 s i izračunajte ΔAT = A2T- A1T, ΔAB= A2B- A1B, ΔA =ΔAT-ΔAB. Praznu epruvetu potrebno je napraviti samo 1-2 puta.

Iii. Izračun od Ck:

• Izračunato koncentracijom proteina u tkivu:

Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmolof NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 svaki miligram proteina.

aktivnost CK (U/Mg Prot) = ΔA÷(ε × D)×VRT×109 ÷ (VS× Cpr) ÷ T= 268 ×ΔA÷Cpr

• Izračunato prema kvaliteti uzoraka tkiva:

Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmol NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 u svakom gramu uzorka.

aktivnost CK (U/g svježa težina) = ΔA÷(ε × D)×VRT×109 ÷ (VS÷VST×W) ÷T= 268×ΔA÷W

• Izračunato prema volumenu seruma:

Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmol NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 u svakom mililitru seruma.

aktivnost CK (U/ml) = ΔA÷(ε × D)×VRV×109 ÷ VS÷T= 268×ΔA

• Po broju stanica:

Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmol NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 svaki 10000 stanice.

aktivnost CK (U/104cell)= ΔA ÷(ε × D)× vrv × 109 ÷(VS ÷ VST×N)÷T=268 ×ΔA÷ N

 

e.: Koeficijent molarne ekstinkcije NADPH, 6.22× 103 l/mol/cm; d: Svjetlosni promjer kivete, 1 cm;

VRT: Ukupni volumen reakcijskog sustava, 0.001 ml;

Vs: Volumen uzorka u reakcijskom sustavu, 0.2 ml; Vst: Volumen otopine ekstrakta, 1 ml;

CPR: Koncentracija proteina uzorka, mg/ml; W: Masa mase uzorka, g;

N: Broj ćelija, 104 jedinice; T: vrijeme reakcije, 3 minuta.

Bilješka:

1. CK seruma nije stabilan. Uzorci se prikupljaju i mjere što je prije moguće. CK seruma je stabilan za 24 sati nakon skladištenja na 4 ℃ u mraku.
2. Sadržaj bjelančevina u uzorku potrebno je posebno odrediti. BCA protein set za određivanje sadržaja može se koristiti za određivanje.
3. Ako je vrijednost OD veća od 0.6, uzorak se može ispravno razrijediti otopinom ekstrakta, a formula za izračun može se promijeniti prema omjeru razrjeđivanja.
4. ΔAB općenito ne prelazi 01.

Eksperimentalni slučajevi：

1. Uzeti 0,1 g mišjeg mozga, Dodajte 1ml otopine ekstrakta, homogenizirati i samljeti. Uzmi supernatanta, zatim razrijediti ekstraktom 4 puta i otkriti prema izmjerenim koracima. Izračunajte ΔAT=A2T- A1T=0,638-0,149=0,489, ΔAB=A2B-A1B=0， ΔA=ΔAT-ΔAB=0,489-0=0,489, Izračunajte aktivnost enzima prema težini uzorka:

CK aktivnost（ U/g težine） =268×ΔA÷W×4（ omjer razrjeđenja） =268×0,489÷0,1×4（omjer razrjeđenja）

=5242,08U/g težine.

2. Uzmite 200 μL seruma patke za izravnu detekciju, izračunajte ΔAT=A2T-A1T=0,445-0,423=0,022, ΔAB=A2B- A1B=0, ΔA=ΔAT-ΔAB=0,022-0=0,022, izračunati aktivnost enzima prema volumenu seruma:

CK aktivnost（U/mL）=268×ΔA=268×0,022=5,896 U/mL.

Reference：

• Defang Li, U Lu, JichunHan, et al. Eriodictyol ublažava ishemiju miokarda-reperfuzijsku ozljedu putem aktivacije JAK2. Granice u imunologiji. siječnja 2018;(IF3.845)
• Xu Y, Meng X, Ljubav X, et al. Mutant ButhusmartensiiKarsch antitumorsko-analgetičkog peptida pokazuje smanjenu inhibiciju na hNav1. 4 i hNav1. 5 kanala zadržavajući analgetsko djelovanje[J].Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(44):18270-18280

Povezani proizvodi：

BC2030/ BC2035 izocitrat lijaza (ICL) Kit za ispitivanje aktivnosti

BC3170/ BC3175 Acetat kinaza (ACK) set za ispitivanje aktivnosti

BC3120/ BC3125 Biljna dehidrogenaza(PDHA) Kit za ispitivanje aktivnosti

BC4220/ BC4225 4-kumarinska kiselina koenzim A ligaza (4CL) Kit za ispitivanje aktivnosti

BC4220/ BC4225 4-kumarinska kiselina koenzim A ligaza (4CL) Kit za ispitivanje aktivnosti