Kreatin kinaza (Ck) Kit za ispitivanje aktivnosti
Bilješka: Uzmite dva ili tri različita uzorka za predviđanje prije testa.
Operativna oprema: Spektrofotometar
Mačka ne: BC1140
Veličina:50T/48s
Komponente:
Otopina ekstrakta: 60 mL ×1. Skladištenje na 4 ℃.
Reagens i: prah × 1, čuvati na tamnom mjestu na -20 ℃. Otopljen u 10 ML destilirane vode prije upotrebe, neiskorišteni reagens mora se pohraniti na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.
Reagens II: prah × 1, čuvati na -20℃. Otopljen u 0.5 ML destilirane vode prije upotrebe, neiskorišteni reagens mora se pohraniti na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.
Reagens iii: prah × 2, čuvati na -20℃. Otopljen u 0.5 ML destilirane vode prije upotrebe, reagensi koji se ne mogu potrošiti pohranjuju se na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.
Reagens IV: prah × 1, čuvati na -20℃. Otopljen u 0.65 ML destilirane vode prije upotrebe, neiskorišteni reagens mora se pohraniti na -20 ℃ nakon ponovnog pakiranja, ponovno zamrzavanje i odmrzavanje je zabranjeno.
Reagens v: 15 mL ×1. Skladištenje na 4 ℃.
Opis proizvoda:
Kreatin kinaza (Ck) (EC 2.7.3.2) je također poznat kao kreatin fosfokinaza, koji uglavnom postoji u srcu, mišića, i mozak. Može reverzibilno katalizirati trans-fosfornu reakciju između kreatina i ATP-a. To je važna kinaza izravno povezana s prijenosom stanične energije, kontrakcija mišića i regeneracija ATP-a.
CK katalizira kreatin fosfat i ADP za stvaranje kreatina i ATP, heksokinaza katalizira ATP i glukozu za stvaranje glukoza-6-fosfata, a glukoza-6-fosfat dehidrogenaza katalizira glukozu-6- fosfata i NADP+ za stvaranje NADPH, što rezultira povećanjem 340 nm vrijednost apsorpcije svjetlosti, koji se koristi za izražavanje aktivnosti enzima CK.
Potrebni reagensi i oprema, ali nisu pruženi
Vage, niskotemperaturna centrifuga, Stalna temperaturna vodena kupka, spektrofotometar, 1 mL kvarcne kivete i destilirane vode.
Postupak
Ja. Ekstrakcija otopine sirovog enzima:
-
- Uzorak tkiva:
Udio mase tkiva (g): volumen otopine ekstrakta (ml): 1:5~ 10 (preporuča se izvagati oko 0.1 g tkiva, dodati 1 ML otopine ekstrakta) za homogenost ledene kupke. Centrifuga na 10000 × g za 15 minuta na 4 ℃, uzmite supernatant i stavite ga na led za ispitivanje.
- Uzorak seruma:
Izravno određivanje.
- Uzorak stanica:
Broj ćelija (104): volumen otopine ekstrakta(ml) je 500~1000:1 (1 Preporučuje se dodavanje mL otopine ekstrakta 5 milijun stanica), dodaje se otopina ekstrakta, a stanice se razbijaju ultrazvučnim valovima u ledenoj kupelji (Vlast: 300W, ultrazvučni: 3s, interval: 7s, ukupno vrijeme: 3 minuta). Centrifuga na, 10000× g za 10 minuta na 4 ℃, supernatant i stavite ga na led za ispitivanje.
Ii. Test postupak:
- Zagrijte spektrofotometar više od 30 minuta, Podesite valnu duljinu na 340 NM, i namjestiti na nulu destiliranom vodom.
- Radno rješenje: pomiješajte reagens I, Reagens II, Reagens iii, Reagens IV i Reagens V u omjeru 70:4:7:10:90 (omjer volumena) Prije upotrebe. Pripremite kada će se otopina koristiti. Inkubirati za 20 minuta na sobnoj temperaturi prije upotrebe (ovaj korak se ne može izostaviti).
- Operativna tablica: dodajte sljedeće reagense 1 mL kiveta
Ime reagensa (μL) | Prazna cijev (Ab) | Epruveta (NA) |
otopina sirovog enzima | – | 200 |
Radno rješenje | 450 | 450 |
Destilirana voda | 550 | 350 |
Dodajte gornje reagense u 1 ML kvarcna kiveta, dobro ih promiješajte i izmjerite vrijednost apsorbancije A1 na 340 nm za 10 s, brzo ih stavite u vodenu kupelj na 37 ℃ 3 minuta (čitač mikropločica s kontroliranom temperaturom može se postaviti na 37 ℃), izvadite vrijednost apsorbancije A2 na 190 s i izračunajte ΔAT = A2T- A1T, ΔAB= A2B- A1B, ΔA =ΔAT-ΔAB. Praznu epruvetu potrebno je napraviti samo 1-2 puta. |
Iii. Izračun od Ck:
- Izračunato koncentracijom proteina u tkivu:
Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmolof NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 svaki miligram proteina.
aktivnost CK (U/Mg Prot) = ΔA÷(ε × D)×VRT×109 ÷ (VS× Cpr) ÷ T= 268 ×ΔA÷Cpr
- Izračunato prema kvaliteti uzoraka tkiva:
Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmol NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 u svakom gramu uzorka.
aktivnost CK (U/g svježa težina) = ΔA÷(ε × D)×VRT×109 ÷ (VS÷VST×W) ÷T= 268×ΔA÷W
- Izračunato prema volumenu seruma:
Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmol NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 u svakom mililitru seruma.
aktivnost CK (U/ml) = ΔA÷(ε × D)×VRV×109 ÷ VS÷T= 268×ΔA
- Po broju stanica:
Definicija aktivnosti enzima: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira proizvodnju 1 nmol NADPH po minuti na 37 ℃ i pH 7,0 svaki 10000 stanice.
aktivnost CK (U/104cell)= ΔA ÷(ε × D)× vrv × 109 ÷(VS ÷ VST×N)÷T=268 ×ΔA÷ N
e.: Koeficijent molarne ekstinkcije NADPH, 6.22× 103 l/mol/cm; d: Svjetlosni promjer kivete, 1 cm;
VRT: Ukupni volumen reakcijskog sustava, 0.001 ml;
Vs: Volumen uzorka u reakcijskom sustavu, 0.2 ml; Vst: Volumen otopine ekstrakta, 1 ml;
CPR: Koncentracija proteina uzorka, mg/ml; W: Masa mase uzorka, g;
N: Broj ćelija, 104 jedinice; T: vrijeme reakcije, 3 minuta.
Bilješka:
- CK seruma nije stabilan. Uzorci se prikupljaju i mjere što je prije moguće. CK seruma je stabilan za 24 sati nakon skladištenja na 4 ℃ u mraku.
- Sadržaj bjelančevina u uzorku potrebno je posebno odrediti. BCA protein set za određivanje sadržaja može se koristiti za određivanje.
- Ako je vrijednost OD veća od 0.6, uzorak se može ispravno razrijediti otopinom ekstrakta, a formula za izračun može se promijeniti prema omjeru razrjeđivanja.
- ΔAB općenito ne prelazi 01.
Eksperimentalni slučajevi:
- Uzeti 0,1 g mišjeg mozga, Dodajte 1ml otopine ekstrakta, homogenizirati i samljeti. Uzmi supernatanta, zatim razrijediti ekstraktom 4 puta i otkriti prema izmjerenim koracima. Izračunajte ΔAT=A2T- A1T=0,638-0,149=0,489, ΔAB=A2B-A1B=0, ΔA=ΔAT-ΔAB=0,489-0=0,489, Izračunajte aktivnost enzima prema težini uzorka:
CK aktivnost( U/g težine) =268×ΔA÷W×4( omjer razrjeđenja) =268×0,489÷0,1×4(omjer razrjeđenja)
=5242,08U/g težine.
- Uzmite 200 μL seruma patke za izravnu detekciju, izračunajte ΔAT=A2T-A1T=0,445-0,423=0,022, ΔAB=A2B- A1B=0, ΔA=ΔAT-ΔAB=0,022-0=0,022, izračunati aktivnost enzima prema volumenu seruma:
CK aktivnost(U/mL)=268×ΔA=268×0,022=5,896 U/mL.
Reference:
- Defang Li, U Lu, JichunHan, et al. Eriodictyol ublažava ishemiju miokarda-reperfuzijsku ozljedu putem aktivacije JAK2. Granice u imunologiji. siječnja 2018;(IF3.845)
- Xu Y, Meng X, Ljubav X, et al. Mutant ButhusmartensiiKarsch antitumorsko-analgetičkog peptida pokazuje smanjenu inhibiciju na hNav1. 4 i hNav1. 5 kanala zadržavajući analgetsko djelovanje[J].Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(44):18270-18280
Povezani proizvodi:
BC2030/ BC2035 izocitrat lijaza (ICL) Kit za ispitivanje aktivnosti
BC3170/ BC3175 Acetat kinaza (ACK) set za ispitivanje aktivnosti
BC3120/ BC3125 Biljna dehidrogenaza(PDHA) Kit za ispitivanje aktivnosti
BC4220/ BC4225 4-kumarinska kiselina koenzim A ligaza (4CL) Kit za ispitivanje aktivnosti
BC4220/ BC4225 4-kumarinska kiselina koenzim A ligaza (4CL) Kit za ispitivanje aktivnosti
Recenzije
Još nema recenzija.