L'électrophorèse ADN est une technique de laboratoire courante utilisée pour séparer les fragments d'ADN par taille. Il permet aux chercheurs de visualiser, identifier, et purifier les échantillons d'ADN en fonction de leur poids moléculaire.
Comprendre les principes derrière cette technique, ses applications clés, Et une bonne utilisation est essentielle pour toute personne travaillant avec l'analyse d'ADN en biologie moléculaire, médico-légal, diagnostic clinique, et plus. Ce guide fournira un aperçu complet de l'électrophorèse ADN.
Quel est le principe derrière l'électrophorèse ADN?
La séparation des fragments d'ADN par électrophorèse est basée sur la migration des molécules d'ADN chargées négativement à travers une matrice de gel d'agarose sous l'influence d'un champ électrique.
Les principes clés sont:
- Les molécules d'ADN ont une charge négative uniforme en raison de leur squelette phosphate. Cela signifie que leur rapport charge / masse est constant.
- Lorsqu'un courant électrique est appliqué, Les molécules d'ADN chargées négativement seront attirées vers l'électrode positive.
- Le gel d'agarose fournit un effet tamisé qui fait migrer plus rapidement les fragments d'ADN plus petits que les plus grands.
- Donc, au fil du temps, Les fragments d'ADN deviennent séparés par taille, avec des fragments plus petits plus près de l'électrode positive par rapport aux plus grandes.
Comment fonctionne un gel d'agarose?
Les gels d'agarose sont composés de polymères d'agarose extraits d'algues. Lorsque la poudre d'agarose est dissoute dans un tampon et autorisé à régler, il forme un gel contenant de petits pores.
Les caractéristiques des gels d'agarose comprennent:
- La concentration d'agarose détermine la taille des pores. Les pourcentages plus élevés font des pores plus petits.
- Tailles de pores plus petites migration lente mais donne une meilleure séparation des petits fragments d'ADN. Les pores plus gros permettent une migration plus rapide mais une résolution plus faible.
- Les gels sont immergés dans un tampon conducteur qui maintient un pH constant pendant l'électrophorèse. Les tampons communs sont Tae et Tbe.
- Un colorant intercalant comme le bromure d'éthidium est ajouté. Ce colorant s'insère entre les bases d'ADN et permet la visualisation des bandes d'ADN sous la lumière UV.
Ce qui est nécessaire pour exécuter l'électrophorèse ADN?
Le équipement de base et les matériaux pour l'électrophorèse sur gel d'agarose sont:
- Gel d'agarose –Typiquement 0.5-2% concentration d'agarose. Pourcentage plus élevé pour une meilleure séparation des petits fragments.
- Plateau en gel et peigne– Pour lancer le gel avec des puits d'échantillon.
- Réservoir d'électrophorèse– Abrite le gel et le tampon. Contient des électrodes pour appliquer le courant.
- Alimentation électrique –Applique un courant électrique constant, généralement 50-150v.
- Tampon – Communément tae ou tbe pour immerger le gel. Mène le courant.
- Dye de chargement– Contient du glycérol et du bleu bromophénol pour ajouter de la densité et de la couleur aux échantillons d'ADN avant de se charger dans des puits.
- Échelle d'ADN– Un marqueur de poids moléculaire contenant des fragments d'ADN de tailles connues. Utilisé pour identifier les tailles de bande d'échantillons.
- Colorant de coloration – Bromure d'éthidium ou alternative pour visualiser les bandes d'ADN sous la lumière UV.
Quelles sont les étapes clés de l'électrophorèse ADN?
Les étapes clés de l'électrophorèse ADN sont les suivantes:
- Faites un gel d'agarose avec la taille des pores souhaitée et placez-le dans le plateau de gel.
- Ajouter un colorant de coloration au gel.
- Chargez à l'échelle d'ADN et échantillons mélangés à un colorant de chargement dans les puits.
- Immerger le gel dans le tampon d'électrophorèse dans le réservoir.
- Attacher des électrodes et appliquer un courant pour exécuter le gel.
- Éteignez le courant une fois que le front du colorant a migré une distance appropriée.
- Visualisez les bandes d'ADN sous la lumière UV et photographiez-les pour analyse.
- Comparez les tailles de bande à l'échelle d'ADN pour déterminer les longueurs de fragment.
- Acciser les bandes d'ADN du gel pour les applications en aval si nécessaire.
Quelles sont les principales applications de l'électrophorèse ADN?
Il existe de nombreuses utilisations importantes de l'électrophorèse d'ADN à travers la recherche, diagnostic clinique, médico-légal, et biotechnologie:
- Confirmer le succès de l'extraction d'ADN ou RAP amplification en visualisant la présence et la quantité de l'ADN.
- Vérifiez les tailles des fragments d'ADN après PCR, clonage, ou digestion de restriction.
- Comparez les profils ADN pour les tests d'identité en criminalistique.
- Détecter les insertions de gènes, suppressions, ou mutations associées aux troubles génétiques.
- Séparer et purifier les fragments d'ADN d'une taille spécifique, par exemple. pour le clonage.
- Quantifier les quantités relatives d'ADN entre les échantillons par intensité de bande.
- Vérifiez la dégradation de l'ADN ou les contaminants à partir de bandes diffuses ou multiples.
- Préparer l'ADN pour le séquençage, Blots du Sud, ou essais de décalage de mobilité électrophorétique.
Quelles sont les considérations clés lors de l'exécution de gels d'ADN?
Voici quelques considérations clés qui doivent être gardées à l'esprit lors de l'exécution de gels ADN:
- Choisissez une concentration d'agarose adaptée aux tailles de fragments attendues.
- Incluez une échelle d'ADN dans au moins une voie pour permettre l'identification de la taille de la bande.
- Mélanger les échantillons soigneusement avec un colorant de chargement avant de charger des puits.
- Évitez de surcharger des puits d'échantillon avec trop d'ADN.
- Exécuter des gels à une tension appropriée - des tensions plus élevées peuvent provoquer des distorsions de bande.
- Arrêter l'électrophorèse une fois que le front du colorant a migré une distance adéquate.
- Protection d'usure lors de la visualisation de l'ADN avec une lumière UV.
- Photographiez les gels rapidement avant que les bandes diffusent trop.
- Lors de l'excision des bandes d'ADN, Utilisez un scalpel propre sur un plateau UV pour chaque fragment.
Conclusion
Donc, L'électrophorèse ADN est une technique essentielle qui utilise la migration des molécules d'ADN chargées à travers une matrice de gel d'agarose sous un courant électrique pour séparer les fragments par taille. Les applications clés incluent la visualisation des produits de PCR, analyser l'ADN génomique, et purification préparative des fragments d'ADN. Une attention particulière doit être accordée aux principes et aux détails techniques lors de la réalisation d'électrophorèse pour obtenir des résultats optimaux. Avec pratique, L'électrophorèse ADN devient une technique de cheval de bataille fiable pour de nombreux laboratoires de biologie moléculaire.
FAQ
Pourquoi l'électrophorèse sépare-t-elle l'ADN par taille?
Malgré la même densité de charge, L'effet tamisé des pores de gel d'agarose fait que la frottement de l'ADN est proportionnelle à la taille – Les fragments plus petits rencontrent moins de résistance. Il en résulte une séparation basée sur la taille.
Quelle est la précision d'estimation de la taille des fragments d'une échelle d'ADN?
La comparaison avec une échelle fournira une approximation des tailles de bande, généralement à l'intérieur 10% précision. Une taille plus précise nécessite une analyse de fragments spécialisée.
Pourquoi une échelle est-elle courante sur le même gel que les échantillons?
Exécuter une échelle d'ADN à côté des échantillons vous permet de visualiser la migration dans ce gel spécifique et de tenir compte de toute distorsion en bande migration.
Pouvez-vous quantifier la quantité d'ADN directement à partir de l'intensité de la bande?
Tandis que les intensités relatives fournissent une estimation, La quantification précise de l'ADN nécessite des instruments spécialisés comme les spectrophotomètres ou les fluoromètres.
Pourquoi sont croustillants, bandes claires importantes dans l'électrophorèse ADN?
Les bandes d'ADN pointues indiquent intactes, fragments d'ADN purs. Les bandes ou les frottis diffus suggèrent que l'ADN ou les contaminants dégradés comme les restes d'amorces ou de sels qui interfèrent.
L'électrophorèse peut-elle séparer l'ADN par séquence?
Non, L'électrophorèse sur gel d'agarose se sépare uniquement par taille. Cependant, Des techniques spéciales comme DGGE peuvent également se séparer en fonction des différences de séquences mineures.
