Rionucléase h, ou rnase h pour court, est une enzyme d'endoribonucléase avec la capacité déroutante à hydrolyser spécifiquement les liaisons phosphodiester d'un brin d'ARN qui est hybride en ADN. Bien que son activité semble paradoxale, La RNase H joue un rôle crucial dans les processus cellulaires fondamentaux en ciblant sélectivement les parties d'ARN dans les hybrides d'ARN-ADN. La nature radicale de ses capacités de clivage spécifiques au site en fait un outil polyvalent dans les techniques de biologie moléculaire.
Ici, nous explorerons en profondeur ce que fait la RNase H, Comment ça marche, Les principales caractéristiques et applications du produit RNase H recombinant de NEB, et aider les chercheurs à choisir la bonne enzyme RNase H pour leurs besoins.
Quelle est la fonction de la RNase H?
La fonction principale de la RNase H est de cliver le brin d'ARN des duplex d'ARN-ADN, laisser le brin d'ADN intact. Cette digestion ciblée de l'ARN aide à résoudre les intersections hybrides d'ARN-ADN qui peuvent se former pendant les transactions d'ADN et d'ARN à l'intérieur des cellules. L'activité de la RNase H est cruciale pour divers processus métaboliques de l'ADN et de l'ARN comme la réplication de l'ADN, transcription, et maturation des fragments d'Okazaki.
Il empêche les amorces d'ARN de persister dans l'ADN et élimine les transcrits d'ARN hybridés à des modèles d'ADN complémentaires. Ce processus de ciblage et de décomposition de la partie ARN spécifiquement lors de la protection de la partie ADN est au cœur du rôle que la RNase H joue pour faciliter les transactions d'acide nucléique in vivo.
Comment fonctionne la RNase H et quelle est son activité enzymatique?
La RNase H fonctionne en localisant les régions hybrides d'ARN-ADN, puis en clivant avec précision les liaisons phosphodiester entre le 3′-Groupe hydroxyle de l'ARN ribose et du groupe phosphate du prochain ribose d'ARN dans la chaîne. Il catalyse une réaction d'hydrolyse acide-base sans perturber l'intégrité du brin d'ADN.
Au niveau moléculaire, La RNase H reconnaît les jonctions d'ARN-ADN et se lie fortement à la structure duplex. Son site actif coupe ensuite les liaisons phosphodiester du brin d'ARN une par une procédure dans le 3′ à 5′ direction. Ce processus se poursuit jusqu'à ce que l'ensemble du segment d'ARN soit dégradé sans affecter le partenaire ADN. Cette activité enzymatique ciblée est appelée activité RNase H et est quantifiée comme la quantité de RNase H requise pour cliver une quantité spécifique d'ARN dans un hybride d'ARN-ARN dans une période donnée dans des conditions définies.
Quelles sont les principales fonctionnalités et applications du produit RNase H de NEB?
La Nouvelle-Angleterre Biolabs ou NEB est l'un des principaux fournisseurs d'enzymes de haute qualité pour les applications de biologie moléculaire. Leur RNase H recombinante est une enzyme raffinée avec plusieurs caractéristiques avantageuses. Il est fourni avec un tampon de réaction optimisé pour soutenir son activité sur un pH large et une plage de température. En tant que produit recombinant, Il offre une cohérence entre les lots sans contaminants.
La RNase H de Neb montre une fonction et une spécificité RNase H élevée, digérer le brin d'ARN avec la RNase H d'un hybride d'ARN-ADN sélectivement sans déranger l'ADN. Il a des applications dans des techniques comme la transcription inverse RAP (RT-PCR) où il aide à résoudre les hybrides d'ARN-CDNA formés pendant la synthèse du premier brin par activité RNase H. La RNase H thermostable de Neb est également disponible pour les applications d'acide nucléique à plus haute température.
Quelles conditions et tampons sont nécessaires pour une activité RNase H optimale?
Pour une activité RNase H optimale, La RNase H recombinante de NEB nécessite des conditions de réaction et des composants de tampon spécifiques. Le tampon de réaction 10x RNase H fourni est composé de Tris-HCl, KCl, MgCl2, et dTT pour maintenir la force ionique correcte et le pH pour une fonction enzymatique maximale. La RNase H fonctionne mieux au pH 8.3 et 37 ° C. L'inclusion des ions Mg2 + dans le tampon est importante car la fonction RNase H dépend de Mg2 + pour son activité catalytique.
Le DTT agit comme un agent réducteur pour protéger l'enzyme de l'oxydation. Les réactions sont configurées en combinant l'enzyme RNase H, hybride et tampon d'ARN-ADN substrat à une concentration de 1x. Une tampon appropriée améliore la stabilité de la RNase H et le clivage cohérent de la fraction d'ARN à partir d'hybrides.
Quels types d'acides nucléiques RNASE H active-t-on et ne pas agissent?
Bien que la RNase H cible sélectivement l'ARN dans l'ARN-ADN du duplex, il ne digère pas l'ARN ou l'ADN simple brin. Il ne cligne pas non plus l'ADN double brin. Son activité RNase H enzymatique précise est particulière pour l'ARN hybride au brin d'ADN. L'enzyme identifie et dégrade efficacement la partie ARN d'un hétéroduplex d'ARN-ADN sans perturber l'intégrité et la continuité du partenaire ADN.
La RNase H présente peu ou pas d'activité sur les brins d'acide nucléique singulières ou sur des molécules d'ADN double brin qui n'ont pas de jonction d'ARN-ADN. Cette spécificité stricte de substrat permet l'élimination contrôlée et ciblée de l'ARN des complexes hybrides essentiels pour diverses transactions d'acide nucléique.
Quelle est la source et la méthode de production de la RNase recombinante de NEB?
La RNase H de Neb est produite de manière recombinante en e.coli pour la haute pureté et la consistance entre les lots. La source de clonage est le gène RNase H natif isolé d'Escherichia coli qui codes pour la RNase H endogène présente dans les cellules e.coli. Ce gène est inséré dans un vecteur d'expression et amplifié dans une souche e.coli non pathogène. L'induction du vecteur entraîne une expression de protéine RNase H recombinante de haut niveau.
La RNase H surexprimée est ensuite purifiée en utilisant une chromatographie sur colonne pour obtenir une préparation hautement purifiée exempte de nucléases contaminantes. Les contrôles de contrôle de la qualité certifient l'enzyme recombinante présente une activité et une spécificité authentiques de la RNase H. Le produit final est fourni avec un tampon de réaction optimisé pour sa fonction.
Comment la RNase H de Neb est-elle utilisée dans les techniques de biologie moléculaire comme RT-PCR?
Une application importante de la RNase H est en transcription inverse PCR (RT-PCR) où il aide à résoudre les hybrides d'ARN-CDNA formés pendant le premier brin synthèse d'ADNc. Dans RT-PCR, Un modèle d'ARN est d'abord transcrit à l'envers à son ADN complémentaire (ADNc) Utilisation d'une amorce ADN. Ce processus entraîne des duplex hybrides d'ARN-CDNA. La RNase H recombinante de NEB est ensuite utilisée pour dégrader sélectivement le brin d'ARN de ces hybrides ne laissant que l'ADNc simple brin.
La dégradation du modèle d'ARN d'origine l'empêche d'interférer avec l'amplification de PCR ultérieure. En clivant efficacement l'ARN, La RNase H permet une amplification exponentielle du seul ADNc pour détecter et analyser des transcrits d'ARN spécifiques. Sa précision et son efficacité dans l'ARN hybridé dégradant dans des conditions optimisées améliorent la qualité et la sensibilité de l'analyse RT-PCR.
Quelles sont les plages de température et les points d'inactivation de la chaleur pour la RNase H de Neb?
La RNase H ordinaire de NEB est active entre 25 et 42 ° C avec une activité maximale autour de 37 ° C. Il est irréversiblement inactivé lors du chauffage à 65 ° C pour 20 minutes. Pour les applications nécessitant des températures plus élevées, NEB propose également une variante thermostable de la RNase H. Cette RNase H résistante à la chaleur est entièrement fonctionnelle entre 25 et 80 ° C avec une activité croissante à des températures élevées jusqu'à 50 à 60 ° C.
Il reste stable même après le chauffage à 80 ° C, Le rendre adapté à des techniques exigeantes d'acide nucléique fonctionnent dans des conditions de cyclisme thermique plus élevées. La RNase H thermostable peut résister aux étapes d'inactivation de la chaleur et au traitement de la protéinase K, offrir plus de flexibilité. Les deux versions RNase H sont fournies avec une documentation approfondie de produits pour une utilisation efficace.
Comment choisir entre la RNase H régulière et thermostable de NEB?
Le choix entre la RNase H régulière et thermostable dépend des exigences de température et du flux de travail. La RNase H régulière est une option rentable si des réactions peuvent être effectuées en dessous de 42 ° C, Comme dans RT-PCR standard. La RNase H thermostable offre des avantages pour les techniques impliquant des cycles de chaleur élevés de 50 à 80 ° C comme la PCR imbriquée, Amplification isotherme médiée par la boucle inverse (Lampe), et d'autres applications de profilage thermique. Ses propriétés résistantes à la chaleur empêchent sa perte d'activité pendant plusieurs étapes de chauffage.
Les chercheurs effectuant une analyse de l'acide nucléique à haute température bénéficient de la plage fonctionnelle étendue de la RNase H thermostable et de la durabilité. Dans l'ensemble, Les enzymes RNase H recombinantes de NEB fournissent des outils fiables pour la digestion contrôlée de l'ARN dans les complexes d'ARN-ADN à travers une large gamme d'utilisations.
Résumé
En conclusion, Ce billet de blog visait à expliquer de manière exhaustive ce qu'est la RNase H, comment il fonctionne spécifiquement, Les principaux attributs des produits RNase H recombinants de NEB, conditions de réaction optimales, Applications dans des techniques comme RT-PCR, et des considérations pour choisir la bonne enzyme RNase H.
En plongeant dans son activité enzymatique intrigante et ses capacités ciblées de clivage de l'ARN d'une manière simple mais détaillée, J'espère que cela aide à faire la lumière sur la RNase H polyvalente et son rôle important dans les transactions d'acide nucléique. S'il vous plaît laissez-moi savoir si un autre aspect a besoin de plus de clarification.
