La réaction en chaîne de la polymérase (RAP) est un outil essentiel en biologie moléculaire et diagnostic. Au cœur de chaque réaction de PCR est le mélange maître – Un cocktail prémade contenant tous les ingrédients clés pour l'amplification de l'ADN. Mais ce qui se passe exactement dans ce composant PCR crucial? Et quelles considérations devraient être consacrées à la formulation du mélange maître parfait pour vos expériences? Ce guide complet décompose tout en termes simples.
Qu'est-ce qu'un mélange de maître PCR?
UN PCR Master Mix est un prémélacé, Solution prête à l'emploi contenant tous les composants essentiels pour la réaction en chaîne par polymérase, à l'exception du modèle ADN et des amorces. Il comprend généralement:
- Enzyme de l'ADN polymérase
- Désoxynucléotides (dNTP)
- Tampon de réaction
- Chlorure de magnésium
- Stabilisateurs et amplificateurs
En préparant un mélange maître, Vous pouvez aliquoter la même formulation optimisée en plusieurs tubes de réaction ou puits d'une plaque. Cela fait gagner du temps, réduit les erreurs, et améliore la cohérence par rapport à l'ajout de chaque composant individuellement à chaque réaction.
Les mélanges maîtres sont un changeur de jeu PCR, Permettre une configuration d'expérience à haut débit simplifiée. Que vous effectuiez des PCR de routine ou que vous analysez des milliers d'échantillons, Un Master Mix rationalise le flux de travail.
Quels sont les types de mélanges maîtres de PCR?
Il existe de nombreux produits Master Mix optimisés pour différents types d'applications de PCR:
- PCR standard –Pour une amplification de l'ADN de routine. Contient des polymérases non-résistantes.
- PCR à haute fidélité– Utilise des polymérases de relecture pour le clonage, séquençage, ou des applications nécessitant une grande précision.
- Multiplex PCR – Contient des amorces équilibrées pour la co-amplification de plusieurs cibles en une réaction.
- QPCR en temps réel – Comprend des journalistes fluorescents comme des sondes ou des colorants ADN pour la quantification.
- RT-PCR – Contient une enzyme de transcriptase inverse pour amplifier les modèles d'ARN.
- PCR HOT START – Utilise la polymérase activée par la chaleur bloquée par les inhibiteurs pour améliorer la spécificité en réduisant les produits d'amplification parasites.
- PCR à cyclisme rapide – Permet des protocoles de thermocyclage rapides pour une augmentation du débit.
De nombreux mélanges maîtres sont également préoptimisés pour une utilisation sur certains instruments de PCR ou chimies de détection comme les sondes Taqman. Faites donc correspondre le mélange spécialisé à votre protocole de PCR particulier, cibles, et plate-forme pour les meilleurs résultats.
Mix maître QPCR pour les expériences en temps réel
Pour la PCR quantitative en temps réel (qPCR) expériences, Les mélanges maîtres QPCR spécialisés contiennent des sondes marquées par fluorescence ou des colorants de liaison à l'ADN pour permettre la détection et la quantification des produits de PCR lorsqu'ils s'accumulent dans “en temps réel” Pendant le thermocycling.
Certains types de mélange maître QPCR en temps réel comprennent:
- SYBR Vert – Colorant intercalant qui fluoresce lorsqu'il est lié à l'ADN double brin.
- Sonde Taqman – Des sondes de councher de fluorophore clivées pendant l'amplification.
- Balise moléculaire – Sondes en épingle à cheveux fluorescentes avec un exhabitation pour réduire le fond.
- Sonde d'hybridation – Fret Based Adjacent Probes for Signal Generation.
L'utilisation d'un mélange maître formulé et optimisé pour votre chimie particulière de détection QPCR simplifie la configuration de la réaction et fournit une fiable, Résultats sensibles.
Comment faire un mélange de maître de PCR?
Tandis que les produits de maîtrise commerciale de haute qualité sont largement disponibles, Vous pouvez également créer votre mélange de PCR Master personnalisé. Là, les étapes clés sont impliquées:
1. Choisissez une enzyme d'ADN polymérase
C'est le composant le plus important qui catalyse l'amplification de l'ADN. Les options populaires incluent le taq, PFU, Q5, Phusion, CODE, Tth. Considérons la procédés, précision, taux d'extension, et compatibilité avec les tampons de PCR lors de la sélection d'une enzyme.
2. Préparer le tampon de réaction de PCR optimisé
Le tampon fournit un pH idéal, concentrations de sel, et compatibilité du cofacteur pour l'activité de la polymérase. Les composants communs sont:
- Tris-HCl pH 8.5 – Maintient le pH neutre aux températures d'extension
- KCl ou (TH4)2SO4 – Cations monovalentes pour la conductivité
- MgCl2 – Cofacteur de cation divalent essentiel pour la polymérase
- PCR – Bétaïne, DMSO, Stabilisants comme BSA
3. Ajouter des désoxynucléotides équilibrés (dNTP)
Utilisez un mélange équimolaire de DATP, dCTP, dGTP, dTTP. La concentration standard est 100-200 μm chacun dNTP.
4. Inclure des cofacteurs essentiels
Chlorure de magnésium (MgCl2) est un cofacteur crucial pour l'activité et la spécificité de la polymérase. Inclure à 1-5 Concentration finale MM.
5. Ajouter des stabilisateurs
Détergents non ioniques, TNT, trèfle, etc.. aider à maintenir l'activité de la polymérase pendant le stockage.
6. Ajuster les concentrations de composants
Pour plus de commodité, Faites un mélange maître concentré 2x ou 4x en doublant ou quadrupler des quantités de composants.
7. Mélanger les composants soigneusement avant d'aliéler
Vortex vigoureusement ou pipette à plusieurs reprises pour assurer un mélange maître homogène.
8. Faire des aliquotes à usage unique pour le stockage
Évitez les cycles de congélation. Pour de meilleurs résultats, Stockez les aliquotes congelées et décongelées sur la glace avant utilisation.
Lorsque vous développez pour la première fois votre mélange de maître, Suivez les recettes de tampon et les concentrations de composants suggérées par le fabricant de polymérase comme point de départ.
Optimiser les concentrations par des tests itératifs pour maximiser l'efficacité, spécificité, sensibilité, et cohérence pour votre protocole de PCR particulier, instrument, et application.
Comment utiliser un mélange de PCR Master
L'utilisation d'un mélange de maître de PCR dans vos réactions ne pourrait pas être plus facile. Voici un aperçu rapide étape par étape:
- Dégel – Laissez le maître réfrigéré mélange complètement sur la glace.
- Vortex – Bien mélanger par le vortex ou les pipetage de haut en bas pour assurer l'homogénéité avant d'aliéler.
- Aliquote – Dispenser le volume approprié du mélange maître par réaction dans des tubes de PCR ou des puits de plaque en fonction de la taille de la réaction.
- Ajouter des amorces – Pipette vers l'avant et les amorces inversées dans chaque tube de réaction / puits.
- Ajouter un modèle – Ajouter l'échantillon d'ADN ou une autre matrice à chaque réaction.
- Se débarrasser de – Si nécessaire, Ajouter une eau de qualité PCR supplémentaire pour atteindre le volume de réaction souhaité final.
- Mélanger – Vortex ou pipette doucement mélange pour combiner tous les composants dans chaque réaction.
- Centrifuger – Tournez brièvement les tubes / plaques pour collecter le contenu en bas.
- RAP – Placez les réactions dans un thermal cycler et démarrez votre course de PCR!
Lorsque vous utilisez un mélange de maître, Ajoutez toujours le modèle d'ADN en dernier, Après les amorces, Pour éviter la contamination croisée entre les réactions.
Comment PCR Master Mix propose l'amplification de l'ADN?
Un mélange principal de PCR contient les ingrédients essentiels pour l'amplification de l'ADN dans un format prêt à l'emploi. L'utilisation d'un mélange maître simplifie la configuration de la réaction, réduit les erreurs, et améliore la cohérence.
Différents types de mélanges maîtres optimisés sont disponibles pour la PCR standard, qPCR, PCR à haute fidélité, RT-PCR, et plus. Vous pouvez également faire votre propre mélange personnalisé, Mais les produits commerciaux offrent des tests et une commodité de qualité importants.
Comprendre PCR Master Mix aide à garantir des résultats réussis pour tous vos besoins d'amplification. Avec le pouvoir de Master Mix dans votre boîte à outils de biologie moléculaire, L'expérimentation de l'ADN devient facile.
