Lipase hépatique (HL) Kit de test d'activité
Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.
Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre
Chat non: BC2380
Taille:50T/24S
Composants:
Réactif I: 100 mL×1. Stockage à 4℃.
Réactif II: 3 mL×1. Stockage à 4℃.
Réactif III: Poudre × 1. Stockage à 4℃. Avant utilisation, ajouter 30 mL d'eau distillée, se dissoudre complètement.
Réactif IV: Poudre × 2. Stockage à -20℃. Avant utilisation, ajouter 2 ml d'eau distillée à celle, se dissoudre complètement. Le réactif dissous peut être stocké à -20 ° C après le reconditionnement. Évitez les cycles de gel répétés;
Standard: Poudre × 1. Avant utilisation, 6.94 ml de acétone est ajouté pour préparer un 10 μmol / ml α-naphthol
solution standard, qui a été entièrement dissous avant utilisation.
Description du produit:
Lipase hépatique (HL) est une enzyme lipolytique synthétisée dans les cellules parenchymateuses hépatiques. Il est présent à la surface des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et à la surface du microville hépatocytaire dans l'espace sinusoïdal, et peut hydrolyser divers lipoprotéines. Les triglycérides (TG) et phospholipides (PL) En milieu, changez la taille et la densité de diverses particules de lipoprotéines. Lorsque le HL et son activité dans le plasma augmentent, il peut entraîner des lipoprotéines à basse densité (LDL) niveaux dans le plasma, augmenter et accélérer l'occurrence et le développement de l'athérosclérose.
HL hydrolyse l'acétate d'α-naphtyle pour produire de l'α-naphtol, qui peut former un composé azo rouge violet avec du sel B Fast Blue. Il a un pic d'absorption caractéristique à 595 nm, et sa profondeur de couleur est positivement corrélée avec l'activité d'estérase hépatique dans une certaine plage.
Réactifs et équipements requis mais non fournis:
Spectrophotomètre, bain d'eau, équilibre, centrifuger, transfert de transfert réglable, 1 Cuvette en verre ml, mortier/homogénéisateur, broyeur à ultrasons, glace et eau distillée.
Procédure:
je. Enzyme extraction
- Tissu
Selon la masse tissulaire (g): le volume de réactif i (ml) est 1:5~ 10 pour extraire. Il est recommandé d'ajouter 1 ml de réactif i à 0.1 g de tissu, et entièrement homogénéisé sur le bain de glace. Centrifuger à 10000g pour 10 minutes à 4℃ pour éliminer les matières insolubles, et prendre le surnageant sur la glace avant de tester.
- Bactéries ou cellules
Selon les bactéries ou les cellules (104): le volume de réactif i (ml) est 500~1000:1. Il est recommandé d'ajouter 1 ml de réactif i à 5 millions de bactéries ou de cellules. Utilisez une ultrasonication pour diviser les bactéries et les cellules (placé sur la glace, puissance ultrasonique 300W, temps de travail 3s, intervalle 7s, temps total 3 min). Centrifuger à, 10000g pour 10 minutes à 4 ℃ pour éliminer les matériaux insolubles et prendre le surnageant sur la glace avant de tester.
- Medium de culture ou autre liquide: Détecter directement.
II. Détection
- Spectrophotomètre de préchauffage pour 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 595 nm, mettre à zéro avec de l'eau distillée.
- Préchauffer le réactif III à 30 ℃ pour plus de 20 minutes.
- Standard: Diluer la solution standard de 10 μmol / ml pour 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078μmol / ml avec réactif I.
- Ajouter les réactifs suivants dans 1.5 Tubes ML EP:
| Tube de contraste (C) | Tube à essai (T) | Tube standard (S) | Tube vierge (B) | |
| Échantillon (µL) | 100 | 100 | – | – |
| Solution standard (µL) | – | – | 100 | – |
| Réactif I (µL) | 450 | 400 | 400 | 500 |
| Réactif II (µL) | – | 50 | 50 | 50 |
| Mélanger et réagir pour 10 Le mien à 30 ℃ | – | – | ||
| Réactif III (µL) | 400 | 400 | 400 | 400 |
| Réactif IV (µL) | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Mélanger soigneusement et détecter l'absorbance à 595 nm, Enregistrer comme AC, À, As et AB respectivement. Δat =(AT-AC), Δas =(AS-AB). Un tube de contraste est requis pour chaque tube à essai, et la courbe standard ne doit être testée qu'une ou deux fois. | ||||
III. Calcul:
1.Courbe standard
La concentration de solution standard comme axe x, Δas comme axe y, obtenir l'équation y = kx + b. Prendre Δat à l'équation pour acquérir x (µmol/mL) valeur.
2. Calcul
- Concentration de protéines tissulaires
Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse l'hydrolyse de l'acétate d'α-naphtyle pour générer 1 μmol de α-naphthol chaque mg de protéine dans le système de réaction par minute à 40 ℃.
Activité HL (U/mg prot)= x × vs ÷ （vs × cpr） ÷ t = 0,1x ÷ cpr
- Poids tissulaire
Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme l'enzyme de quantité qui catalyse l'hydrolyse de l'acétate d'α-naphtyle pour générer 1 μmol de α-naphthol chaque gramme de tissu dans le système de réaction par minute à 40 ℃.
Activité HL (U/g poids) = x × vs ÷(W × vs ÷ ve)÷ t = 0,0333x ÷ w
- Liquide
Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse l'hydrolyse de l'acétate d'α-naphtyle pour générer 1 μmol de α-naphtol tous les millilitres d'échantillon de liquide dans le système de réaction par minute à 40 ℃.
Activité HL (U/mL) = x × vs ÷ vs ÷ t = 0,1x
- Bactéries ou cellules cultivées
Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse l'hydrolyse de l'acétate d'α-naphtyle pour générer 1 μmol de α-naphthol chaque 104 cellules ou bactéries dans le système de réaction par minute à 40 ℃.
Activité HL (Cellule U/104) = x × ve ÷ montant de la cellule ÷ t = 0,1x ÷ montant de la cellule
Contre: Volume d'échantillon (ml), 0.1 ml; Ve: Extraire le volume de la solution, 1 ml;
Cpr: Concentration en protéines de l'échantillon surnageant (mg/ml); T: Temps de réaction (min), 10 minutes;
W: Poids de l'échantillon, g;
Quantité de cellules: 10 mille comme unité.
Note:
- Si l'échantillon est un foie d'animaux, il est recommandé de diluer l'échantillon avec un réactif i plus que 25 fois avant les tests, et multiplier le facteur de dilution dans le calcul
- Si l'échantillon est du sérum ou du plasma d'animaux obèses, il est recommandé de diluer l'échantillon avec un réactif i plus que 5 fois avant les tests, et multiplier le facteur de dilution dans le calcul
- Quand Δa est supérieur à 0.8, il est recommandé de mesurer l'échantillon après l'avoir dilué avec le réactif, et le multiplier par le facteur de dilution dans le calcul
Exemple expérimental:
- 1Le foie de rat G a été pris pour le traitement des échantillons, Et le surnageant est dilué 24 fois, Ensuite, l'opération est effectuée en fonction des étapes de l'opération. Mesuré et calculé par 96 bien plaque: ΔA = AT-AB = 0,713-0,001 = 0,712, Et la courbe standard: y = 0,6381x – 0.0005, calculer x = 1,1166
Activité HL (U/g masse) = x × vs ÷ (W × vs ÷ vst)÷ t × 48 = 53.597 U/g masse.
- Après le dilué du sérum de dinde 6 fois, L'opération a été effectuée en fonction des étapes de l'opération. Mesuré et calculé par 96 bien plaque: ΔA = AT-AB = 0,572-0,003 = 0,569, Et la courbe standard: y = 0,6381x – 0.0005, calculer x = 892
Activité HL (U/g masse) = x × vs ÷ (W × vs ÷ vst)÷ t × 12 = 1.071 U/g masse
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