Créatine Kinase Solarbio (CK) Kit de test d'activité

Créatine Kinase (CK) Kit de test d'activité

Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.

Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre

Chat non: BC1140

Taille:50T/48S

Composants:

Extraire la solution: 60 ml × 1. Stockage à 4℃.

Réactif I: poudre × 1, stocké dans l'obscurité à -20 ℃. Dissous dans 10 mL d'eau distillée avant utilisation, Le réactif inutilisé doit être stocké à -20 ℃ après avoir reconditionné, Le congélation et le dégel répétés sont interdits.

Réactif II: poudre × 1, stocké à -20 ℃. Dissous dans 0.5 mL d'eau distillée avant utilisation, Le réactif inutilisé doit être stocké à -20 ℃ après avoir reconditionné, Le congélation et le dégel répétés sont interdits.

Réactif III: poudre × 2, stocké à -20 ℃. Dissous dans 0.5 mL d'eau distillée avant utilisation, Les réactifs qui ne peuvent pas être utilisés doivent être stockés à -20 ℃ après avoir reconditionné, Le congélation et le dégel répétés sont interdits.

Réactif IV: poudre × 1, stocké à -20 ℃. Dissous dans 0.65 mL d'eau distillée avant utilisation, Le réactif inutilisé doit être stocké à -20 ℃ après avoir reconditionné, Le congélation et le dégel répétés sont interdits.

Réactif V: 15 ml × 1. Stockage à 4℃.

 

Description du produit:

Créatine kinase (CK) (CE 2.7.3.2) est également connu sous le nom de créatine phosphokinase, qui existe principalement dans le cœur, muscle, et cerveau. Il peut catalyser de manière réversible la réaction trans-phosphore entre la créatine et l'ATP. C'est une kinase importante directement liée au transport d'énergie cellulaire, Contraction musculaire et régénération de l'ATP.

CK catalyse la créatine phosphate et ADP pour générer la créatine et l'ATP, l'hexokinase catalyse l'ATP et le glucose pour générer du glucose-6-phosphate, et le glucose-6-phosphate déshydrogénase catalyse le glucose-6- phosphate et NADP + pour générer NADPH, entraînant une augmentation de 340 Valeur d'absorption de lumière NM, qui est utilisé pour exprimer l'activité enzymatique CK.

Réactifs et équipements requis mais non fournis

Balance, centrifugeuse basse température, bain d'eau à température constante, spectrophotomètre, 1 Cuvette de quartz ML et eau distillée.

Procédure

je. Extraction d'une solution enzymatique brute:

1. 1. Échantillon de tissu:

La proportion de masse tissulaire (g): Volume de solution d'extrait (ml): 1:5~10 (il est recommandé de peser environ 0.1 g de tissu, ajouter 1 mL de solution d'extrait) pour l'homogénéité du bain de glace. Centrifuger à 10000 ×g pour 15 minutes à 4℃, Prenez le surnageant et placez-le sur la glace pour tester.

2. Échantillon de sérum:

Détermination directe.

3. Échantillon de cellules:

Le nombre de cellules (104): Le volume de la solution d'extrait(ml) est 500~1000:1 (1 ML de solution d'extrait est recommandé pour être ajouté à 5 millions de cellules), La solution d'extrait est ajoutée, et les cellules sont brisées par une vague à ultrasons dans le bain de glace (Pouvoir: 300W, ultrasonique: 3s, intervalle: 7s, temps total: 3 minutes). Centrifuger à, 10000×g pour 10 minutes à 4℃, le surnageant et le placer sur la glace pour tester.

II. Test procédure:

1. Préchauffer le spectrophotomètre pendant plus que 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 340 nm, et s'adapter à zéro avec de l'eau distillée.
2. Solution de travail: mélanger le réactif i, Réactif II, Réactif III, Réactif IV et réactif V dans la proportion de 70:4:7:10:90 (rapport de volume) Avant utilisation. Préparer quand la solution sera utilisée. Incuber pour 20 minutes à température ambiante avant l'utilisation (Cette étape ne peut pas être omise).
3. Tableau d'opération: Ajouter les réactifs suivants dans 1 CUVETTE ML

Nom du réactif (µL)	Tube vierge (UN B)	Éprouvette (À)
solution enzymatique brute	–	200
Solution de travail	450	450
Eau distillée	550	350
Ajoutez les réactifs ci-dessus dans le 1 CUVETTE DE QUARTZ ML, les mélanger bien et mesurer la valeur d'absorbance A1 à 340 nm pour 10 s, Placez-les rapidement dans un bain d'eau de 37 ℃ pour 3 minutes (Le lecteur de microplaques à température contrôlée peut être réglé à 37 ℃), retirer la valeur d'absorbance A2 à 190 s et calculer le Δat = a2t- A1T, ΔAB = A2B- A1b, ΔA = Δat-ΔAB. Le tube vierge ne doit être fait que 1 à 2 fois.

III. Calcul de CK:

• Calculé par concentration de protéines tissulaires:

Définition de l'activité enzymatique: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyser la production de 1 nmolof nadph par minute à 37 ℃ et pH7,0 chaque milligramme de protéines.

Activité CK (U/mg prot) = ΔA ÷(ε × d)× VRT × 109 ÷ (Vs × cpr) ÷ t = 268 × ΔA ÷ CPR

• Calculé par la qualité des échantillons de tissus:

Définition de l'activité enzymatique: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyser la production de 1 nmol de nadph par minute à 37 ℃ et pH7,0 dans chaque gramme d'échantillon.

Activité CK (Poids frais U / g) = ΔA ÷(ε × d)× VRT × 109 ÷ (Vs ÷ vst × w) ÷ t = 268 × Δa ÷ w

• Calculé par volume sérique:

Définition de l'activité enzymatique: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyser la production de 1 nmol de nadph par minute à 37 ℃ et pH7,0 dans chaque millilitre de sérum.

Activité CK (U/mL) = ΔA ÷(ε × d)× VRV × 109 ÷ vs ÷ t = 268 × Δa

• Par le nombre de cellules:

Définition de l'activité enzymatique: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme catalyser la production de 1 nmol de nadph par minute à 37 ℃ et pH7.0 chaque 10000 cellules.

Activité CK (U/104cellule)= ΔA ÷(ε × d)× VRV × 109 ÷(Vs ÷ vst × n)÷ t = 268 × Δa ÷ n

 

e: Coefficient d'extinction molaire de NADPH, 6.22× 103 L / mol / cm; d: Diamètre de la lumière de la cuve, 1 cm;

VRT: Volume total de système de réaction, 0.001 ml;

CONTRE: Le volume d'échantillon dans le système de réaction, 0.2 ml; Vst: Le volume de solution d'extrait, 1 ml;

Cpr: Concentration de protéines de l'échantillon, mg/ml; W: La masse de la masse d'échantillon, g;

N: Le nombre de cellules, 104 unités; T: temps de réaction, 3 minutes.

Note:

1. Le CK du sérum n'est pas stable. Les échantillons sont prélevés et mesurés dès que possible. Le CK du sérum est stable pour 24 heures après avoir été stockées à 4 ℃ dans l'obscurité.
2. La teneur en protéines de l'échantillon doit être déterminée séparément. Protéine BCA Le kit de détermination du contenu peut être utilisé pour la détermination.
3. Si la valeur OD est supérieure à 0.6, L'échantillon peut être dilué correctement avec la solution d'extrait, et la formule de calcul peut être modifiée en fonction du rapport de dilution.
4. ΔAB ne dépasse généralement pas 01.

Instances expérimentales：

1. Prendre 0,1 g de cerveau de souris, ajouter 1 ml de solution d'extrait, homogénat et moudre. Prenez le surnageant, puis diluer avec l'extrait 4 fois et détecter selon les étapes mesurées. Calculer Δat = a2t- A1T = 0,638-0.149 = 0,489, ΔAB = A2B-A1B = 0， Δa = Δat-ΔAB = 0,489-0 = 0,489, calculer l'activité enzymatique en fonction du poids de l'échantillon:

Activité CK （Poids U / G） = 268 × ΔA ÷ W × 4 （Ratio de dilution） = 268 × 0,489 ÷ 0,1 × 4 （Ratio de dilution）））

= 5242.08u / g de poids.

2. Prendre 200 μl de sérum de canard pour détecter directement, calculer Δat = a2t-a1t = 0,445-0,423 = 0,022, ΔAB = A2B- A1b = 0, Δa = Δat-ΔAB = 0,022-0 = 0,022, Calculez l'activité enzymatique en fonction du volume du sérum:

Activité CK （U / ml） = 268 × ΔA = 268 × 0,022 = 5,896 U / ml.

Les références：

• Defang Li, À Lu, Jichunhan, et al.erioddictyol atténue une lésion d'ischémie-reperfusion myocardique par l'activation de JAK2. Frontières en immunologie. Janvier 2018;(If3.845)
• Xu Y, Meng X, Hou x, et autres. Un mutant du Buthusmartensiikarsch antitumor-analgésique peptide a été réduit en inhibition à Hnav1. 4 et hnav1. 5 canaux tout en conservant l'activité analgésique[J.].Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(44):18270-18280

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