Kit d'analyse de la teneur en fer cellulaire
Note: Il faut prévoir 2-3 échantillons de grande différence avant la détermination formelle. Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre
Chat non: BC5310
Taille:50T/48S
Composants:
Extraire la solution: Liquide 30 mL×1. Conserver à 2-8 ℃.
Réactif I: Liquide 15 mL×1. Conserver à 2-8 ℃. Réactif II: Liquide 35 mL×1. Conserver à 2-8 ℃. Réactif III: Liquide 6 mL×1. Conserver à 2-8 ℃.
Standard: Liquide 1 mL×1. Conserver à 2-8 ℃. 1 µmol/mL de solution étalon Fe3+. Ajouter 200 μL d’eau distillée à 200 μL de solution étalon Fe3+ de 1 µmol/mL avant utilisation, et bien mélanger pour former la solution étalon Fe3+ de 0.5 µmol/mL.
Description du produit:
Le fer est l'un des oligoéléments essentiels du corps humain, qui est le composant principal de l'hémoglobine, myoglobine, cytochrome, et d'autres systèmes enzymatiques. Le fer peut aider au transport de l’oxygène et favoriser l’oxydation des graisses. Une carence en fer peut facilement provoquer une anémie, et troubles métaboliques, et affectent la fonction immunitaire du corps.
Fe3+ est réduit par le chlorhydrate d'hydroxylamine en Fe2+. Fe2+ pourrait réagir avec le monohydrate de phénanthroline pour former une sorte de composé orange dans des conditions acides faibles., qui présente un pic d'absorption à 510 nm. Selon la mesure, absorbance à 520 nm peut refléter la concentration en fer des cellules.
Réactifs et équipements requis mais non fournis:
Spectrophotomètre, centrifugeuse de bureau, pipette réglable, 1Cuvette en verre ml, broyeur à ultrasons de cellules, glace, eau distillée.
Procédure:
- La préparation des échantillons:
- Recueillir des bactéries ou des cellules dans le tube à centrifuger, et jeter le surnageant après centrifugation. Selon la proportion de bactéries ou le nombre de cellules (104): Extraire le volume de la solution (ml) de 500-1000-1 extraire. Il est suggéré que 5 millions de bactéries ou de cellules représentent 0,5 ml de solution d'extrait. Divisez la bactérie ou la cellule par ultrasons (placé sur la glace, puissance ultrasonique 200W, temps de travail 3s, intervalle 7s, répéter 30 fois). Centrifuger à 8000 g pour 10 minutes à 4℃ pour éliminer les matières insolubles, et mettre le surnageant sur de la glace avant
- Le temps de travail des ultrasons pourrait être prolongé correctement si les échantillons sont des champignons, bactéries, ou d'autres micro-organismes avec des cellules
II. Détermination procédure:
- Préchauffer le spectrophotomètre pendant 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 510 nm, et mettre à zéro avec distillé
- Ajoutez des réactifs avec les éléments suivants:
| Réactif (µL) | Tube à essai (À) | Tube vierge (UN B) | Tube standard (COMME) |
| Échantillon | 100 | – | – |
| Eau distillée | – | 100 | – |
| Solution standard (0.5 µmol/mL) | – | – | 100 |
| Réactif I | 200 | 200 | 200 |
| Réactif Ⅱ | 600 | 600 | 600 |
| Réactif Ⅲ | 100 | 100 | 100 |
| Bien mélanger, et placer à 25℃ pendant 10 minutes. Prendre 1 ml de solution réactionnelle dans une cuvette en verre de 1 ml. Mesurer l'absorbance à 510 nm, enregistré comme AT, UN B, et COMME. ΔAT = AT-AB, ΔAS=AS-AB. Les tubes vierges et les tubes standards ne doivent être testés qu'une ou deux fois. | |||
III. Teneur en fer cellulaire Calculs
- Nombre de bactéries/cellules
Teneur en fer cellulaire (de/104 cellules) =(Cs × ΔAT÷ΔAS)×VE×103×55,845÷500=27,922×ΔAT÷ΔAS
2) Protéine concentration
Teneur en fer cellulaire (de/mg prot)
=(Cs × ΔAT÷ΔAS)×VE×103×55,845÷(Cpr × VE)=27922,5×ΔAT÷ΔAS÷Cpr
Cs: Concentration de la solution étalon Fe3+, 0.5µmol/mL;
VE: Extraire le volume de la solution, 0.5 ml;
103: Facteur de conversion d'unité, 1 µmol=103 nmol;
55.845: Masse moléculaire relative de Fe, 55.845de/nmol; 500: Nombre total de bactéries ou de cellules, 5 million;
Cpr: Concentration en protéines de l'échantillon surnageant, mg/ml.
Note:
- Si ΔAT < 01, il est recommandé d'augmenter la taille du surnageant de l'échantillon avant la détermination. Si AT>1, il est recommandé de diluer le surnageant de l'échantillon avec de l'eau distillée avant la détermination. Et modifiez la formule de calcul.
- La concentration en protéines du surnageant de l'échantillon doit être mesurée par vous-même si la teneur en fer cellulaire est calculée par protéine.
Exemple expérimental:
- Prendre 5 millions de cellules, ajouter 0.5 mL de solution d'extrait, et divisé par ultrasons. Centrifuger et prélever le surnageant. Puis opérer selon les étapes de détermination, calculer ΔAT=AT-AB= 0.171- 0.000=0,171, ΔAS=AS-AB=0,573-0,000=0,573. Le résultat est calculé en fonction du nombre de cellules: Teneur en fer cellulaire (de/104 cellules) =27,922×ΔAT÷ΔAS=8,333ng/104 cellule
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