Kit de detección de mutaciones del gen EGFR humano (Método de PCR-fluorescencia) 12T para la investigación

Descripción del Producto:

• Nombre: Kit de detección de mutación del gen EGFR
• Objetivo: Detección cualitativa de 11 Mutaciones comunes en el gen EGFR humano.
• Especímenes: Muestras de ADN de secciones embebidas en parafina de pacientes diagnosticados clínicamente con cáncer de pulmón de células no pequeñas.
• Verificación: El producto se ha verificado para el rendimiento de detección de las mutaciones del gen objetivo, pero no se ha combinado con medicamentos específicos en ensayos clínicos.

Uso y limitaciones:

• Usar: Los resultados de la detección pueden ayudar a detectar pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas adecuadas para la terapia dirigida por EGFR.
• Limitaciones: Los resultados de detección por sí solos no pueden usarse como la única base para el diagnóstico clínico.

Información previa:

• EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico, una proteína de membrana crucial para la proliferación celular, crecimiento, reparar, y supervivencia de células tumorales.
• Estructura génica: Ubicado en cromosoma 7 (7P12 ~ 14), El gen EGFR comprende 28 exones. Exones 18-24 formar el dominio de tirosina quinasa que codifica el gen.
• Enfoque de mutación: La mayoría de las mutaciones ocurren en exones 18-21, notablemente exón 19 eliminación y exón 21 Mutación L858R.
• Relevancia clínica: Estas mutaciones predicen la eficacia de los medicamentos dirigidos en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas y guían la selección de medicamentos del tratamiento tumoral.
• Requisito de la FDA: La detección de mutación del gen EGFR es obligatoria para pacientes que consideran el tratamiento con EGFR-TKI.

Mesa 1: Mutaciones comunes del gen EGFR

Mutación	Exón	Cambios de secuencia de aminoácidos	Cambios de secuencia base	Identificación cósmica
Ex 18-mu-1	18	G719S	2155GRAMO>A	6252
Ex 18-mu-2	18	G719C	2155GRAMO>t	6253
Ex 18-mu-3	18	G719A	2156GRAMO>C	6239
Ex 19-mu-1	19	Glu746-aa750del	2235-2249del	6223
Ex 20-mu-1	20	S768i	2303GRAMO>t	6241
Ex 20-mu-2	20	T790M	2369C>t	6240
Ex 20-mu-3	20	V769-D770inSasv	2307_2308insgccagcgtg	12376
Ex 20-mu-4	20	H773-V774Insh	2319_2320inscac	12377
Ex 20-mu-5	20	D770-n771insg	2310_2311inggt	12378
Ex 21-mu-1	21	L858	2573t>GRAMO	6224
Ex 21-mu-2	21	L861Q	2582t>A	6213

Principio de prueba

Este kit está diseñado para detectar mutaciones específicas en el gen EGFR. Incluye cebadores y sondas para detectar:

1. Mutaciones G719X (G719S, G719C, G719A) en exón 18,
2. Mutaciones de eliminación de exón 19 (incluyendo 2235-2249del 15),
3. Mutaciones S768i y T790M en exón 20,
4. Tres tipos de mutaciones de inserción (2307_2308insgccagcgtg, 2319_2320inscac, y 2310_2311Inggt),
5. Mutaciones L858R y L861Q en exón 21.

Durante la detección de mutaciones, Si la muestra contiene plantillas de ADN mutacionales:

• Los cebadores y las sondas específicas de la mutación detectada se unirán al ADN de la plantilla.
• PCR La amplificación ocurrirá, Liberación de señales de fluorescencia.
• El monitoreo y salida en tiempo real de la resistencia a la señal de fluorescencia se realizará utilizando un amplificador de PCR cuantitativo fluorescente.

Si la muestra no contiene plantillas de ADN mutacionales:

• Los cebadores y las sondas específicas de la mutación no se unirán al ADN de la plantilla, o su encuadernación será bloqueado.
• Esto no dará como resultado una amplificación de PCR o una amplificación de PCR inhibida.
• Como consecuencia, No se liberarán señales de fluorescencia.

En general, El kit permite un análisis cualitativo de los resultados de detección a través del monitoreo en tiempo real de las señales de fluorescencia durante la amplificación por PCR.

Mesa 2 Ingredientes principales del kit

Tube No.	Nombre de la etiqueta	Ingredientes principales	Especificaciones de embalaje (12 pruebas/kit)	Especificaciones de embalaje (24 pruebas/kit)
1	G719X REACCIÓN DE PCR LÍQUIDO	Búfer de PCR, dNTP, Primer y sonda G719X	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
2	S768I PCR Reacción líquida	Búfer de PCR, dNTP, Primer y sonda S768i	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
3	T790M PCR Reacción líquido	Búfer de PCR, dNTP, Primer y sonda T790M	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
4	L858r reacción de PCR líquido	Búfer de PCR, dNTP, Primer y sonda L858R	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
5	L861Q REACCIÓN DE PCR LÍQUIDO	Búfer de PCR, dNTP, Primer y sonda L861Q	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
6	INS PCR Reacción Líquido	Búfer de PCR, dNTP, Primer y sonda	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
7	Del PCR Reacción Líquido	Búfer de PCR, dNTP, Del primer and probe	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
8	Líquido de reacción de PCR de control de calidad	Búfer de PCR, dNTP, Primer de control de calidad y sonda	1 tubo (290µL)	1 tubo (580µL)
9	Mezcla de enzimas	Mezcla enzimática que contiene enzima Taq y enzima ung	1 tubo (24µL)	1 tubo (48µL)
10	Tinte de referencia	Tinte Rox	1 tubo (45µL)	1 tubo (90µL)
11	Plantilla estándar interna	Plantilla de ADN estándar interna	1 tubo (100µL)	1 tubo (100µL)
12	Control débilmente positivo	Que contiene una plantilla de ADN de mutación	1 tubo (200µL)	1 tubo (200µL)
13	Control en blanco	Tris-HCl buffer (10milímetro)	1 tubo (200µL)	1 tubo (200µL)

Condiciones de almacenamiento y vida útil:

1. La vida útil del kit es 9 meses cuando se almacenan a -20 ℃ ± 5 ℃ y protegidos de la luz.
2. Minimizar la congelación y la descongelación a menos de 6 tiempos durante el uso.
3. La fecha de producción y la fecha de vencimiento se indican en la etiqueta.

Instrumentos aplicables:

1. El kit es compatible con Stratagene MX3000P, AB 7500, y LightCycler 480 Amplificadores de PCR cuantitativos fluorescentes en tiempo real.
2. Use el canal FAM para recolectar señales fluorescentes de la amplificación del gen EGFR, Canal Vic/Joe/Hex para señales de amplificación de genes estándar internos, y configurar la señal de referencia (Rox).

Requisitos de muestra:

1. El ADN de alta calidad es crucial. El kit es adecuado para detectar ADN del genoma humano extraído de tejidos patológicos embebidos en parafina confirmados por un médico para contener tejidos tumorales. Muestras dentro 3 se sugieren años.
2. Kit de extracción de ADN Qiagen (ADN QIAAMP FPE Kit de tejido, No gato. 56404) se recomienda. La concentración de ADN extraída y la pureza deben probarse con un espectrofotómetro UV (OD260/OD280: 1.8-2.0). Diluir el ADN a 10-15 ng/μl y probar inmediatamente o almacenar por debajo de -20 ℃ sin congelación y descongelación repetitivas.

Métodos de prueba:

1. Preparación de reactivos:

1. Permita que el kit alcance la temperatura ambiente, completamente derretido todos los componentes, y centrífuga para 10 segundos.
2. Determinar el número de reacciones (norte) necesario. Preparar 7 tipos de mezclas de reacción de PCR de mutación y mezclas de reacción de PCR de control de calidad de acuerdo con el método especificado en la tabla 3.
3. $norte=\text{Número de especímenes}+\text{Control en blanco (1t)}+\text{Control débilmente positivo (1t)}$
4. Empacar el tubo preparado 1-8 PCR reacción líquido en tubos de reacción de acuerdo con la cantidad de empaque de 23 μl por pozo.
5. Transfiera tubos de reacción de PCR al área de preparación de la muestra. Guarde el reactivo restante en el refrigerador a -20 ℃ ± 5 ℃ para congelar y protección contra la luz.

Mesa 3: Método de preparación de cada sistema de reacción de PCR

Componente	Fórmula del sistema de reacción única	Fórmula de sistemas de reacción N
PCR reacción líquido	22.3µL	22.3× n μl
Mezcla de enzimas	0.2µL	0.2× n μl
Tinte de referencia (Rox)	0.4µL	0.4× n μl
Plantilla estándar interna	0.1µL	0.1× n μl

2. Preparación de muestras:

(Área de preparación de muestras)

1. Extracción del ADN de la muestra:
   • Siga las instrucciones proporcionadas con el kit de extracción de ADN del genoma comercial comprado.
2. Muestra agregando:
   • a) Agregar ADN del genoma, control débilmente positivo, y control en blanco de las muestras para probarse en los tubos de reacción que contienen el 1-8 Mezcla de reacción de PCR. Cada muestra se prueba con 8 tipos de mezcla de reacción de PCR, con una cantidad adicional de 2 μl por pozo. La concentración recomendada de ADN de la muestra es 10-15 ng/μl.
   • b) Si los tubos de reacción de PCR con plantillas agregadas no se pueden colocar inmediatamente en el instrumento debido a situaciones temporales, guárdelos a 2-8 ℃ temporalmente y realice detección en el instrumento lo antes posible dentro de 24 horas.

3. Amplificación por PCR:

(Área de amplificación de ácido nucleico)

1. Inicie el instrumento y realice la autoinspección del rendimiento del instrumento.
2. Tome los tubos de reacción de PCR preparados en el área de preparación de la muestra y colóquelos en las posiciones correspondientes en el tanque de muestra del instrumento. Registre la secuencia de colocación.
3. Configurar parámetros relevantes para la amplificación del ácido nucleico según la tabla 4 e iniciar la amplificación de PCR. Después de completar la reacción, Definir un umbral de fluorescencia apropiado (Generalmente delimitado en el medio de la fase de crecimiento exponencial bajo la forma logarítmica de la curva de amplificación) Para obtener valores de CT para diferentes canales y calcular los valores de CT relevantes de acuerdo con la curva de amplificación.

Mesa 4: Parámetros relevantes de la amplificación del ácido nucleico del instrumento

Condiciones de reacción de PCR	Fase	Condiciones	Número de ciclos
Tratamiento de la UNG	37℃	10 minutos (mín.)	1
Previa a la defensa	95℃	5 minutos (mín.)	1
PCR	95℃	15 segundos (s)	40
	60℃	60 segundos (s)
		(Se recolectan señales de fluorescencia al final de esta fase)

Adquisición de señal:

• Gen EGFR: Se recogen señales de fluorescencia del canal FAM.
• Gen estándar interno: Se recogen señales de fluorescencia del canal Hex/Vic/Joe.

Análisis de resultados:

Después de la finalización de la reacción, El umbral se establece de acuerdo con la curva de amplificación para calcular △ CT (△ CT = Detección de mutación CT – Detección de control de calidad CT) e interpretar los resultados.

Interpretación de los resultados de las pruebas:

1. Determinación de la efectividad del kit:

1. Control débilmente positivo:
   • El valor de CT del canal FAM es ≤32 con una fase de crecimiento exponencial obvia en la curva de amplificación.
2. Control en blanco:
   • El canal FAM no muestra una curva de amplificación o una línea recta o una línea oblicua ligera. No hay fase de crecimiento exponencial obvia, El valor de CT es ≥38.
3. Gen estándar interno:
   • En control en blanco, El valor de CT del canal Hex/Vic/Joe es <38 con una fase de crecimiento exponencial obvia.
   • En el espécimen probado y un tubo de reacción débilmente positivo, La ausencia ocasional de señal en el canal HEX/VIC/JoE cuando el canal FAM tiene una señal puede ocurrir debido a la inhibición de la amplificación estándar interna por la amplificación del gen objetivo.

2. Determinación de la efectividad de la muestra:

1. Líquido de reacción de PCR de control de calidad:
   • Para el canal de la familia, Connecticut < 23, indicando una sobredosis de ADN del genoma de la muestra. Revestimiento sugerido después de la dilución.
2. Líquido de reacción de PCR de control de calidad:
   • Para el canal de la familia, 23 ≤ CT ≤ 30, indicando dosis moderada de ADN del genoma de la muestra.
3. Líquido de reacción de PCR de control de calidad:
   • Para el canal de la familia, 30 < Connecticut < 34, indicando una dosis más baja de ADN del genoma de la muestra. El tipo de mutación se puede probar solo en muestras con mayor contenido de ADN de mutación.
4. Líquido de reacción de PCR de control de calidad:
   • Para el canal de la familia, CT ≥ 34, indicando una dosis de adición demasiado baja del ADN del genoma de la muestra. Requiere la preparación de un nuevo espécimen o la adición de la cantidad de uso para la detección.

3. Determinación de los resultados de detección:

Después de determinar la efectividad de la detección, Calcule el valor △ CT de las muestras de detección efectivas y determine los resultados de detección de acuerdo con los siguientes pasos y la tabla 5 Para confirmar la presencia de mutación en el espécimen.

1. En la detección de mutaciones de la muestra, valor ct > 36 indica que la muestra es negativa o por debajo del límite de detección inferior de este kit.
2. En la detección de mutaciones de la muestra, Si el valor CT es ≤ 36, Calcule el valor △ CT de este tubo de reacción. Si el valor △ CT es menor que el valor de corte △ CT correspondiente, El espécimen se considera positivo para mutaciones. De lo contrario, se considera una mutación negativa o por debajo del límite de detección inferior de este kit.
3. Aplicando los criterios de determinación anteriores, El tipo de mutación de la muestra positiva G719X puede ser uno de los G719s, G719C, y G719a. El tipo de mutación de la muestra positiva de INS puede ser uno de V769-D770inSasv, H773-V774Insh, y d770-n771insg. Este producto no puede dividirse más.

Mesa 5: Determinación de resultados

Reacción líquido	Tipo de mutación	Negativo	Positivo
G719X REACCIÓN DE PCR LÍQUIDO	G719X	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 7
S768I PCR Reacción líquida	S768i	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 7
T790M PCR Reacción líquido	T790M	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 7
L858r reacción de PCR líquido	L858	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 7
L861Q REACCIÓN DE PCR LÍQUIDO	L861Q	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 7
INS PCR Reacción Líquido	Informes	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 6
Del PCR Reacción Líquido	Del	Connecticut > 36 o sin valor CT	CT ≤ 36, ΔCt ≥ 6

Limitaciones de los métodos de prueba:

1. La precisión de los resultados de la detección de muestras depende de la calidad de la recolección de muestras, tratamiento, y almacenamiento. Los errores en estos procesos pueden conducir a resultados de detección inexactos. La mala calidad del ADN durante el tratamiento con la muestra puede dar lugar a resultados falsos negativos. Para el canal FAM del líquido de reacción de PCR de control de calidad, muestras con valores de CT entre 23 y 30 indicar una calidad de ADN relativamente buena y adición de muestra moderada, resultando en los resultados de detección más precisos.
2. Los resultados negativos obtenidos de la detección de muestras no pueden descartar la presencia de mutaciones con baja abundancia o mutaciones en otros loci del gen EGFR.
3. Los resultados de detección de este kit están destinados a referencia clínica para guiar la medicina personalizada y no deben usarse como la única base para el diagnóstico clínico.

Índices de rendimiento del producto:

1. El kit está completamente lleno sin desbordamiento de contenido. La etiqueta está intacta con un claro contenido de identificación. La composición del kit es correcta sin repetición o componentes faltantes.
2. Se detecta referencia específica utilizando el 7 Tipos de líquido de reacción de mutación incluido en el kit, y todos los resultados de detección son negativos.
3. La sensibilidad de las mutaciones correspondientes se detecta utilizando el 7 Tipos de líquido de reacción de mutación incluido en el kit, y todos los resultados de detección son positivos.
4. El límite más bajo de detección puede alcanzar 1%, Permitir la detección de varios tipos de mutaciones del gen EGFR en 20ng Genome DNA.
5. El kit se usa para detectar repetidamente la referencia de precisión del gen EGFR 10 veces, con un coeficiente de variación intraensayado (CV) de ≤5%.

Precauciones:

1. Este kit está destinado solo al diagnóstico in vitro.
2. No mezcle reactivos de este kit con los de otros lotes.
3. El control débilmente positivo en este kit no es contagioso, sino que debe manejarse como material potencialmente infeccioso.
4. Los reactivos residuales en el kit y los desechos experimentales deben manejarse de acuerdo con las pautas de eliminación de residuos médicos.

Referencias:

1. Pautas de práctica clínica de NCCN en oncología – Guía de cáncer de pulmón de células no pequeñas (Edición china), V1.2009.
2. Huang Jie, Qu Shoufang, et al. Establecimiento de materiales de control de mutaciones del gen EGFR humano EGFR. Revista china de análisis farmacéutico, 2011, 31(9):1758-1763.
3. Consenso de expertos sobre la detección de mutaciones genéticas del receptor del factor de crecimiento epidérmico de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas en China. Revista china de patología, 2011, 40(10).