Kit de ensayo de ácido nucleico del virus hepatitis B (Método de sonda-fluorescente de PCR) Para la investigación

【Nombre del producto】 Kit de ensayo de ácido nucleico del virus hepatitis B (PCR-Método de sonda fluorescente)

【Especificación de paquete】48 Pruebas/ kit

Uso previsto

• El kit está destinado a la determinación cuantitativa del virus de la hepatitis B (VHB) ácido nucleico (ADN) en muestras de suero o de plasma.
• Se utiliza para pacientes que requieren pruebas de infección por VHB y aquellos que se someten a terapia antiviral para la hepatitis B.
• Diseñado para monitorear la respuesta al tratamiento antiviral y evaluar la efectividad del tratamiento al rastrear los niveles de ADN del VHB en la sangre del paciente.
• Sin embargo, La prueba no debe confiarse únicamente como un indicador de la condición de un paciente.
• Debe usarse junto con manifestaciones clínicas y otras pruebas de laboratorio para evaluar la condición general del paciente.
• Este kit no es adecuado para fines de detección de sangre del VHB.

Principio de prueba

• El kit emplea cuentas magnéticas conformacionales tanto para lisas como para purificar ácidos nucleicos virales en un tubo de amplificación de PCR estándar.
• El reactivo de amplificación por PCR se agrega directamente al mismo tubo, Permitir que las cuentas participen directamente en la reacción de PCR cuantitativa fluorescente.
• Se utiliza la tecnología de sonda Taqman, en donde el 5 ’→ 3′ La actividad de exonucleasa de ácido nucleico de la ADN polimerasa Taq degrada la sonda Taqman durante la PCR.
• Esta degradación separa el grupo reportero fluorescente del grupo enfriado, generar una señal fluorescente.
• El sistema de detección de PCR fluorescente en tiempo real recoge esta señal en tiempo real, habilitar la determinación cuantitativa del contenido viral en la muestra.
• Las muestras de suero clínicas que contienen el virus de la hepatitis B inactivado sirven como calibradores y controles de calidad para el kit.
• El kit monitorea los inhibidores de la PCR en la muestra detectando estándares internos, mitigar el riesgo de falsos negativos.

Componentes

Kit de ensayo de ácido nucleico del virus hepatitis B (Método de sonda fluorescente de PCR) Para la investigación
El sería número	Composición de productos		Componentes principales	Tamaño y cantidad
DLB	Reactivos de extracción de ácido nucleico	Lisado de HBV con cuentas magnéticas)	Hidróxido de sodio, Base de tnus, Tralatona x-00.cuenta magnética confomatioal	5.5ml x 1 botella
DWB		Solución de enjuague de HBV	Cloruro de potasio, Tritón X-100	15.0ml x l botella
1	PCR amplifica el reactivo de catión	HBV PCRREEACTIONSOLUTIM	cebadores, sondas, desoxirribonucleósido trifosfato, Magnesium iones pcr.duffe	1.10ml x 2 tubos
2		Mezcla de enzimas de HBV	ADN polimerasa y glicosilasa uracílica	110μl x 1 tubo
3	Calibración Producto	Calibrador de HBV ①(10-3.0)× 10*iuvml	Valor constante Muestra de suero positivo HBV (inactivado)	0.35 ml x 1 tubo
4		Calibrador de HBV ②(1.0-3.0)× l0iuvml	Valor constante Muestra de suero positivo HBV (inactivado)	0.35 ml x i tubo
5		Calibrador de HBV ③(1.0-3.0)× 10*iu/ml	Valor constante Muestra de suero positivo HBV (inactivado)	0.35 ml x l tubo
6		Calibrador de HBV ④(1.0-3.0)× 10 I/ml	Valor constante Muestra de suero positivo HBV (inactivado)	0.35 ml x 1 tubo
7	Producto de control de calidad	VHB muy positivo C(10-5.0110)× 10 I/ml	Muestra de suero mixto BV positivo (inactivado)	0.35 ml x l tubo
8		CONTROL CRÍTICO DE CALIDAD POSITIVA CRÍTICA DE VHB (10-100)IUM	Muestra de suero mixto BV positivo (inactivado)	0.35 ml x i tubo
9		Control de calidad negativa de HBV	Muestra de suero mixto VHB-negativo (inactivado)	0.35 ml x i tubo
10	Interno etiqueta	Etiqueta interna de HBV	Plantilla de ácido nucleico estándar interno	60μl x l tubo

Notas: a. Hay diferencias por lotes a lotes en los parámetros de los calibradores ① a ④ y el Valores fijos de QC positivos fuertes y QC críticos positivos (todo dentro del rango anterior). Para más detalles, Consulte la hoja de instrucciones adjunta al kit.

1. No mezcle componentes de diferentes lotes de kits!
2. Traiga sus elementos de prueba: 0.2Ml Tubos de reacción de PCR, centrífugo, Varios tamaños de pipetas y puntas, y soporte magnético, y use nuestro stand magnético recomendado.

Condiciones de almacenamiento y fecha de vencimiento

• Kit de extracción de ácido nucleico, transportado a temperatura ambiente y almacenado a 2-8 ° C.
• Kit de amplificación por PCR, transportado no más alto que 10 °C, almacenado en -20 ° C ± 5 ° C lejos de la luz, evitar
• Repetido congelamiento de descongelación (no más de 3 veces).
• Fecha de vencimiento: El kit es válido para 12 meses, Úselo dentro de la fecha de vencimiento. Consulte la etiqueta para obtener detalles de la fecha de producción y la fecha de vencimiento.

Aplicable Instrumentos

Para usar con LightCycler® 480, Slan-96p, Mx3005p, e instrumentos de PCR de fluorescencia en tiempo real ABI7500.

Solicitud de muestra

1. Tipo de muestra adecuado: suero o plasma
2. Recolección de muestras: Este kit es adecuado para muestras de suero o plasma..

muestra de suero: 5 Ml de sangre venosa se recoge del sujeto utilizando una jeringa estéril y se coloca en un tubo de centrífuga estéril a temperatura ambiente para no más que 6 horas y dejado para precipitar por su cuenta, o centrifugado directamente a 1600 g para 5 minutos y el sobrenadante (tener cuidado de no aspirar a los glóbulos rojos) se transfiere a un tubo de centrífuga estéril.

Muestra de plasma: 2 ml o 5 Ml de sangre venosa se recoge del sujeto utilizando una jeringa estéril, inyectado en un tubo de recolección estéril que contiene anticoagulante EDTA, mezclado, y dejado a temperatura ambiente para no más de 6 horas para permitir que la muestra precipite por su cuenta, o directamente centrifugado a 1600 g para 5 minutos para separar el plasma y transferido a un tubo de centrífuga estéril.

3. Almacenamiento: Las muestras a probar después del tratamiento anterior se pueden usar de inmediato para realizar pruebas, Si no está en el tiempo, deben almacenarse congelados por debajo de -20 ° C para evitar la congelación y descongelación repetidas.

4. Transporte: Las muestras deben transportarse en una caja de espuma con hielo o una jarra de hielo, en estado congelado y sellado.

Método de prueba

(i) Preparación de reactivos (Área de preparación de reactivos)

Preparación de lisado de HBV:

1. Mezclar completamente el lisado de HBV (DLB) que contiene cuentas magnéticas.
2. Retire varios componentes de reactivos y permita que se equilibren a temperatura ambiente, protegido de la luz.
3. Mezcle el lisado de HBV y el estándar interno de HBV en una relación de 100 μl/persona + 1.0 μl/persona, y mezclar bien.
4. Dispensar la mezcla inmediatamente en tubos de amplificación de PCR (0.2 ML tubos individuales, 0.2 Ml tubos de octeto, o placas de PCR de 96 pocillos) en 100 μL/pozo, Asegurar que el lisado de VHB esté en la parte inferior del tubo.

Preparación de reactivos de amplificación por PCR:

• Tiempo de configuración: La preparación de reactivos se realiza después de que los tubos de extracción de ácido nucleico se hayan colocado en la rejilla magnética.
• Preparación: Basado en las muestras a probar, preparar el control de calidad negativa de HBV, CONTROL CRÍTICO DE CALIDAD POSITIVA CRÍTICA DE VHB, HBV Control de calidad positivo fuerte, y calibrador de HBV.
• Para cantidades de ① a ④, Tome cantidades correspondientes de solución de reacción de PCR de VHB y mezcla de enzimas de VHB, y mezclar según (Solución de reacción de PCR de HBV 43.0 μl/persona + Mezcla de enzimas de HBV (2.0 μl/persona)), Mezclar bien para formar PCR-MIX para uso inmediato.

(II) Purificación de ácido nucleico (área de procesamiento de muestras)

1. Agregar 100 μL de la muestra a probar o control de calidad negativa de HBV, CONTROL CRÍTICO DE CALIDAD POSITIVA CRÍTICA DE VHB, HBV Control de calidad positivo fuerte, Calibrador de HBV ① a ④ al tubo de PCR en el que se ha dispensado el lisado de HBV; Mezclar suavemente soplando 3 a 5 veces; dejar a temperatura ambiente para 5 a 10 minutos.
2. Transfiera los tubos de PCR a un soporte magnético, dejar por 2-3 minutos, y aspirar al sobrenadante usando una pipeta o un dispositivo de presión negativa, teniendo cuidado de no eliminar las cuentas magnéticas.
3. Mantenga los tubos de PCR en un soporte magnético, agregar 250 μL de solución de enjuague de VHB (DWB) a cada pozo, dejar por 2 minutos y aspirar al sobrenadante con una pipeta o un dispositivo de presión negativa, tener cuidado de no dejar ningún residuo.

Adición de reactivos de amplificación (área de procesamiento de muestras)

• Agregar 45.0 μL de PCR-MIX a cada pozo.
• Cape el tubo y lo invierta.
• Alegre suavemente las cuentas para garantizar una mezcla completa de la mezcla de PCR con las cuentas.
• Centrifugarse instantáneamente el tubo horizontalmente.
• Transfiera los tubos de PCR al área de detección.
• Colóquelos en un instrumento de PCR fluorescente para detectar.

amplificación por PCR (zona de detección)

Coloque el tubo de reacción de PCR en el amplificador, Establezca el control negativo de HBV, HBV Control positivo fuerte, CONTROL CRÍTICO POSITIVO CRÍTICO DE HBV, Calibrador de VHB ① a ④ y la muestra que se probará en el orden correspondiente, y establezca el nombre de la muestra y la concentración del calibrador.

Configuración del programa de amplificación.

Slan-96p en el ejemplo (LightCycler® 480, SLAN-96P y MX3005P, ABI7500 tiene la misma configuración. Una vez configurado, Guarde el archivo y ejecute el programa de reacción

Acceso a los resultados

1. Descripción de la curva de amplificación: La curva de amplificación generalmente tiene forma de S.
2. Configuración de línea de base: Dependiendo de la situación experimental, Se debe seleccionar una sección con un valor de fondo de fluorescencia estable como rango de configuración de línea de base.
3. Ajuste umbral: Simplemente exceda el punto más alto de la curva de amplificación del control de calidad negativo.
4. Análisis de resultados: Una vez que se han establecido las líneas de base y umbral, Los resultados se pueden analizar.

Seleccione el canal FAM para obtener los resultados de la muestra a probar y el control de calidad; Seleccione el canal HEX o VIC para obtener los resultados del estándar interno. (Nota: Consulte los manuales de los diferentes instrumentos para obtener configuraciones detalladas.)

Valores de referencia

El límite inferior de detección y límite de cuantificación para este kit es 5 Iu/ml, Determinado por pruebas de investigación con valores de referencia de ≤40 para Target CT y ≤40 para CT estándar interno.

Juicio de la validez del experimento

1. Los calibradores fueron todos positivos y tenían un coeficiente de correlación lineal|r|≥0.980.
2. Un control de calidad negativo no debe ser detectable y tener un valor de CT estándar interno ≤ 40.
3. Los controles muy positivos tienen un valor de CT <25 y un rango de cuantificación de (1.0-5.0) X 105 Iu/ml Los controles críticamente positivos tienen un valor de CT <38 y un rango de cuantificación de (10- 100) Iu/ml. Los requisitos anteriores deben cumplirse en el mismo experimento., de lo contrario, Los resultados de la prueba se consideran inválidos y deben ser retirados.

Interpretación de los resultados de las pruebas

1. Si el resultado de la muestra es 5-2.0 X 109 IU/ml y la curva de amplificación muestra una forma de S, Mientras que el valor de CT de muestra es ≤40 y el valor CT estándar interno es ≤40, Se considera que el resultado es válido y los valores de concentración positivos y correspondientes se pueden informar directamente.
2. Si el resultado de la muestra es >2.0 X 109 IU/ml y la curva de amplificación muestra una forma de S, la muestra El valor de CT es ≤40, y el valor CT estándar interno es ≤40, se puede informar directamente como ADN de HBV >2.0 X 109 Iu/ml. Si se requiere cuantificación precisa, La muestra se puede diluir a continuación 2.0 X 109 Iu/ml y reestructurado
3. Si el resultado de la muestra es ADN de HBV <5Iu/ml, El valor de CT de muestra es ≤40 y el valor CT estándar interno es ≤40, El resultado se informa como concentración de ADN de VHB por debajo del límite inferior de detección del kit; Si el estándar interno es anormal (Connecticut >40 o ningún valor), El resultado de la muestra no es válido y la causa debe encontrarse y excluirse y la muestra debe repetirse (Si el resultado de la prueba repetida sigue siendo inválida, por favor contáctenos). (Si el resultado de la prueba de repetición aún no es válido, por favor contáctenos).