| Attribut | Einzelheiten |
|---|---|
| Katzennummer | SN0020 |
| Größe | 50T/100T |
| Lagerung | Gespeichert bei 4 °C für kurze Lagerung. Für längere Lagerung, Das Kit kann bei aufbewahrt werden -20 °C bzw -80 °C. |
Kit-Komponenten
| Komponenten | 50T | 100T |
| Lysepuffer | 100ml | 200ml |
| Reagenz A | 2.5ml | 5ml |
| Mittlerer Puffer | 25ml | 50ml |
| Puffer speichern | 5ml | 10ml |
Produktbeschreibung
- Isoliert reine Kerne aus tierischen Zellen und Geweben (weich: Leber/Gehirn, hart: Muskel, kultiviert)
- Anwendungen: Zelltod (Apoptose), Signalisierung, Stoffwechsel & Proteinstudien
- Proteinfreie Kerne & Nuklease-Kontamination
Protokoll
Probenvorbereitung:
- Taschentücher:
- Nehmen Sie 100–200 mg frisches Gewebe (Leber, Gehirn, Herz)
- Mit PBS/Kochsalzlösung waschen, trocken, in kleine Stücke schneiden
- Mit 1 ml vorgekühltem Ly10is-Puffer homogenisieren & 50µL Reagenz A (Eisbad, 20X)
- Kultivierte Zellen:
- Zellen verdauen und waschen
- Zentrifuge (5-10Mindest, 800G), Überstand verwerfen, sammeln & Zellen zählen
- Resuspendieren 5×10^7 Zellen in 1 ml vorgekühltem Lysepuffer
- Fügen Sie 50 µL Reagenz A hinzu, homogenisieren (Eisbad, 20-30X)
Nukleare Isolation:
- Übertragen Sie das Homogenat in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge (5Mindest, 700G, 4°C), Überstand verwerfen (Kernschrot bleibt übrig).
- Kernpellet mit 0,5 ml vorgekühltem Lysepuffer resuspendieren.
- In ein neues Röhrchen mit 0,5 ml Mediumpuffer umfüllen (sorgfältig geschichtet).
- Zentrifuge (5Mindest, 700G, 4°C), Überstand verwerfen (Kernschrot bleibt übrig).
- Kernpellet mit 5 ml Mediumpuffer resuspendieren.
- Zentrifuge (10Mindest, 1000G, 4°C), Überstand verwerfen (gereinigtes Kernpellet).
Lagerung:
- Gereinigte Kerne in 50–100 μl Store Buffer oder dem gewünschten Puffer resuspendieren.
- Die Kerne sind gebrauchsfertig oder können bei -70 °C gelagert werden
Anmerkungen:
Gewährleistung vollständiger Kerne:
- Niedrige Temperatur: Führen Sie den gesamten Vorgang bei niedriger Temperatur durch.
- Geschwindigkeit: Arbeiten Sie während des gesamten Prozesses schnell.
- Zellstörung: Der Schlüssel liegt darin, Zellen aufzubrechen, ohne Organellen zu beschädigen.
- Taschentücher: Verwenden Sie für eine effiziente Homogenisierung einen Glashomogenisator mit kleiner Kapazität und einem eng anliegenden Stößel.
- Kultivierte Zellen: Das Aufbrechen anhaftender Zellen ist schwieriger. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie den kleinen Homogenisator und den festen Stößel.
Zentrifugation:
- Berechnen Sie die richtige Zentrifugalgeschwindigkeit (U/min) basierend auf der gewünschten relativen Zentrifugalkraft (RCF oder g-Kraft) mit der Formel:
- G = 1.11 x 10^-5 x R x (U/min)^2
- G: RCF (G)
- U/min: Umdrehungen pro Minute (kariert)
- R: Rotorradius (cm)
Downstream-Anwendungen:
-
- Für Western Blot und 2D-PAGE, Lysieren Sie die Kernprobe direkt durch Zugabe von Ladepuffer.
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