Nitratreduktase (NR) Assay-Kit (Griess-kolorimetrische Methode)

Produktübersicht

NR (EC 1.7.1.3) ist ein weit verbreitetes Enzym in Pflanzen. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Umwandlung von Nitratstickstoff in Ammoniakstickstoff und ist auch ein induzierbares Enzym, Beeinflussung der Ernteertrag und Qualität. NR katalysiert die Reduktion von Nitrat auf Nitrit: NO3- + NADH+ H+ → NO2- + Sie+ + H2O. Unter sauren Bedingungen, die produzierte NO2- kann an einer Diazotisierungsreaktion teilnehmen, um eine magentafarbene Verbindung zu bilden. Diese Verbindung hat einen Absorptionspeak bei 540 nm, und die Änderung der Absorption bei 540 NM kann verwendet werden, um die Enzymaktivität darzustellen.

Kit-Komponenten

• Induktor -Stammlösung: 50 ml x 1 Flasche
• Extraktionslösung: 30 ml x 1 Flasche
• Reagenz eins: 12 ml x 1 Flasche
• Reagenz zwei: Pulver x 2 Fläschchen
• Reagenz drei: 15 ml x 1 Flasche
• Reagenz vier: 15 ml x 1 Flasche
• Standard: 1 ml x 1 Phiole

Lösungsvorbereitung

1. Induktorlösung: Verdünnen Sie die Induktor-Stammlösung 10-fach mit destilliertem Wasser vor der Verwendung. Nehmen 10 ml der Induktor -Stammlösung und hinzufügen 90 ml destilliertes Wasser. Gründlich mischen. Bereiten Sie vor jedem Gebrauch frisch vor.
2. Reagenz zwei: Hinzufügen 1 ml destilliertes Wasser. Aliquot und bei -20 ° C aufbewahren. Es kann für gespeichert werden 2 Wochen bei -20 ° C.. Vor Gebrauch, Reagenz mit destilliertem Wasser verdünnen Reagenz. Nehmen 10 μl Reagenz zwei und hinzufügen 490 μL destilliertes Wasser. Gut mischen.
3. Standard: Bereiten a 0.1 μmol/ml Natriumnitrit -Standardlösung durch Verdünnung des 10 μmol/ml Natriumnitrit-Standardlösung 100-fach mit destilliertem Wasser vor der Verwendung.

Anmerkungen

1. Wenn die Absorption größer ist als 0.8, Verdünnen Sie die Probe mit Extraktionslösung. Achten Sie darauf, den Verdünnungsfaktor entsprechend in der Berechnungsformel anzupassen.
2. Befolgen Sie streng der Reihenfolge der Hinzufügen von Reagenzien, die in der Proben -Assay -Tabelle für das Experiment aufgeführt sind.

Experimentelle Verfahren

ICH. Probenbehandlung

1. Gewebevorbehandlung:

   • Fügen Sie einem Becherer eine angemessene Menge an Induktor -Lösung hinzu. Frische Proben waschen, Trocknen Sie sie mit Filterpapier, und legen Sie sie in die Induktor -Lösung (genug, um zu untertauchen). Im Dunkeln inkubieren für 2 Std.. Proben entfernen, Trocknen Sie sie mit Filterpapier, und bei -20 ° C einfrieren für 30 Protokoll. Tauen Sie Proben auf und trocknen Sie sie wieder mit Filterpapier. (Durchführen Sie nach Bedarf eine Induktionsbehandlung. Allgemein, Induktionsbehandlung ist nicht erforderlich. Wenn die Ergebnisse vor dem Experiment keine Aktivität zeigen, Induktionsbehandlung ist notwendig.)
   • Ungefähr wiegen 0.1 g Probe und hinzufügen 1 ml Extraktionslösung gemäß dem Verhältnis des Gewebgewichts (G) Lösungsvolumen extrahieren (ml) von 1:5 Zu 10. In einem Eisbad mahlen, Zentrifuge bei 8000 G, 4°C für 10 Protokoll, und sammeln Sie den Überstand. Halten Sie den Überstand zum Testen auf Eis.

2. Vorbehandlung von Zellen oder Bakterien:

   • Sammeln Sie Zell- oder Bakterienproben in einem Zentrifugenröhrchen und verwerfen Sie den Überstand. Hinzufügen 1 ml Extraktionslösung pro 5 Millionen Zellen oder Bakterien. Song der Bakterien oder Zellen (Leistung 200 W, Bohrung 3 Sekunden, Intervall 10 Sekunden, wiederholen 30 mal). Zentrifuge bei 8000 G, 4°C für 10 Protokoll, Sammeln Sie den Überstand und halten Sie ihn zum Testen auf Eis.

II. Testschritte

1. Das sichtbare Spektrophotometer für mindestens vorheizen 30 Protokoll, Passen Sie die Wellenlänge an 540 nm, und Null mit destilliertem Wasser.
2. Beispiel -Assay: