Hepatitis-B-Virus-Nukleinsäure-Assay-Kit (PCR-Fluoreszenzsonden-Methode) Für die Forschung

【Produktname】 Hepatitis-B-Virus-Nukleinsäure-Assay-Kit (PCR-Fluoreszenzsondenmethode)

【Paketspezifikation】48 Tests/Kit

Verwendungszweck

• Das Kit ist für die quantitative Bestimmung des Hepatitis -B -Virus bestimmt (HBV) Nukleinsäure (DNA) in Serum- oder Plasmaproben.
• Es wird für Patienten verwendet, die eine HBV -Infektion testen, und Patienten, die sich einer antiviralen Therapie bei Hepatitis B unterziehen.
• Entwickelt, um die Reaktion auf die antivirale Behandlung zu überwachen und die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten, indem die HBV -DNA -Spiegel im Patientenblut verfolgt werden.
• Jedoch, Der Test sollte nicht nur als Indikator für den Zustand eines Patienten angewiesen werden.
• Es muss neben klinischen Manifestationen und anderen Labortests verwendet werden, um den Gesamtzustand des Patienten zu bewerten.
• Dieses Kit ist nicht für HBV -Blutuntersuchungszwecke geeignet.

Testprinzip

• Das Kit verwendet Konformationsmagnetperlen, um Virus -Nukleinsäuren in einem Standard -PCR -Amplifikationsrohr zu lyse und zu reinigen.
• Das PCR -Amplifikationsreagenz wird dann direkt in das gleiche Rohr hinzugefügt, Ermöglichen, dass die Perlen direkt an der fluoreszierenden quantitativen PCR -Reaktion teilnehmen.
• Die Taqman -Sondentechnologie wird verwendet, wobei die 5 ’→ 3′ Die Nukleinsäure -Exonuklease -Aktivität von Taq -DNA -Polymerase abbaut die Taqman -Sonde während der PCR.
• Dieser Abbau trennt die fluoreszierende Reportergruppe von der gequenchierten Gruppe, Erzeugen eines fluoreszierenden Signals.
• Das PCR-Erkennungssystem in Echtzeit sammelt dieses Signal in Echtzeit, Aktivierung der quantitativen Bestimmung des Virusgehalts in der Stichprobe.
• Klinische Serumproben, die inaktiviertes Hepatitis -B -Virus enthalten, dienen als Kalibratoren und Qualitätskontrollen für das Kit.
• Das Kit überwacht die PCR -Inhibitoren in der Probe, indem sie interne Standards erfassen, Minderung des Risikos falscher Negative.

Komponenten

Anmerkungen: A. Es gibt von Charge zu Charge Unterschiede in den Parametern der Kalibratoren ① Zu ④ und das Feste Werte für stark positive QCs und kritisch positive QCs (alle innerhalb des oben genannten Bereichs). Für Details, siehe die dem Kit beigefügte Gebrauchsanweisung.

1. Mischen Sie keine Komponenten aus verschiedenen Kit-Chargen!
2. Bringen Sie Ihre Testgegenstände mit: 0.2ml PCR-Reaktionsgefäße, Zentrifuge, verschiedene Größen von Pipetten und Spitzen, Und magnetischer Ständer, und verwenden Sie unseren empfohlenen Magnetständer.

Lagerbedingungen und Verfallsdatum

• Nukleinsäure-Extraktionskit, bei Raumtemperatur transportiert und bei 2-8°C gelagert.
• PCR-Amplifikationskit, höchstens transportiert werden 10 °C, gespeichert bei -20 °C ± 5 °C fern von Licht, vermeiden
• wiederholtes Einfrieren und Auftauen (nicht mehr als 3 mal).
• Verfallsdatum: Das Kit ist gültig für 12 Monate, Bitte verwenden Sie es innerhalb des Verfallsdatums. Weitere Informationen zum Produktionsdatum und zum Ablaufdatum finden Sie auf dem Etikett.

Anwendbar Instrumente

Zur Verwendung mit LightCycler® 480, SLAN-96P, Mx3005P, und ABI7500 Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Instrumente.

Musteranfrage

1. Geeigneter Probentyp: Serum oder Plasma
2. Beispielsammlung: Dieses Kit ist für Serum- oder Plasmaproben geeignet.

Serumprobe: 5 Dem Probanden werden mit einer sterilen Spritze ml venöses Blut entnommen und nicht länger als bei Raumtemperatur in ein steriles Zentrifugenröhrchen gegeben 6 Stunden lang stehen gelassen und von selbst ausfallen gelassen, oder direkt bei 1600g zentrifugiert 5 Minuten und der Überstand (Achten Sie darauf, keine roten Blutkörperchen abzusaugen) wird in ein steriles Zentrifugenröhrchen überführt.

Plasmaprobe: 2 ml bzw 5 Mit einer sterilen Spritze werden dem Probanden ml venöses Blut entnommen, In ein steriles Sammelröhrchen mit EDTA-Antikoagulans injiziert, gemischt, und nicht länger als bei Zimmertemperatur belassen 6 Stunden, damit die Probe von selbst ausfällt, oder direkt bei 1600g zentrifugiert 5 Minuten, um das Plasma abzutrennen und in ein steriles Zentrifugenröhrchen zu überführen.

3. Lagerung: Zu testende Proben können nach der oben genannten Behandlung sofort zum Testen verwendet werden, Andernfalls sollten sie gefroren unter -20 °C gelagert werden, um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

4. Transport: Proben sollten in einer Schaumstoffbox mit Eis oder einem Eiskrug transportiert werden, im gefrorenen und versiegelten Zustand.

Testmethode

(ich) Reagenzvorbereitung (Bereich zur Vorbereitung der Reagenzien)

Herstellung von HBV -Lysat:

1. HBV -Lysat gründlich mischen (DLB) mit magnetischen Perlen enthält.
2. Entfernen Sie verschiedene Reagenzkomponenten und lassen Sie sie mit Raumtemperatur äquilibrieren, vor Licht geschützt.
3. Mischen Sie HBV -Lysat und HBV -interner Standard in einem Verhältnis von 100 μl/Person + 1.0 μl/Person, und gründlich mischen.
4. Geben Sie die Mischung sofort in PCR -Verstärkungsrohre aus (0.2 ml Einzelröhrchen, 0.2 ml-Oktettröhrchen, oder 96-Well-PCR-Platten) bei 100 μl/Well, Sicherstellen, dass das HBV -Lysat am Boden des Rohrs liegt.

PCR -Amplifikationsreagenziervorbereitung:

• Konfigurationszeit: Die Reagenzierungspräparation wird durchgeführt, nachdem die Nukleinsäurextraktionsrohre in das magnetische Rack platziert wurden.
• Vorbereitung: Basierend auf den zu testenden Proben, Bereiten Sie die negative Qualitätskontrolle der HBV vor, HBV-kritische positive Qualitätskontrolle, Starke positive HBV-Qualitätskontrolle, und HBV-Kalibrator.
• Für Mengen von ① bis ④, Nehmen Sie entsprechende Mengen an HBV -PCR -Reaktionslösung und HBV -Enzymmischung ein, und gemischt nach (HBV -PCR -Reaktionslösung 43.0 μl/Person + HBV-Enzymmischung (2.0 μl/Person)), Gründlich mischen, um PCR-Mix für den sofortigen Gebrauch zu bilden.

(ii) Nukleinsäurereinigung (Probenverarbeitungsbereich)

1. Hinzufügen 100 μl der zu testenden Probe oder HBV-negative Qualitätskontrolle, HBV-kritische positive Qualitätskontrolle, Starke positive HBV-Qualitätskontrolle, HBV-Kalibrator ① bis ④ in das PCR-Röhrchen geben, in dem das HBV-Lysat dispensiert wurde; Vorsichtig durch Blasen mischen 3 Zu 5 mal; bei Zimmertemperatur stehen lassen 5 Zu 10 Protokoll.
2. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen auf einen Magnetständer, verlassen für 2-3 Protokoll, und den Überstand mit einer Pipette oder einem Unterdruckvorrichtung abzusetzen, Achten Sie darauf, die Magnetperlen nicht zu entfernen.
3. Bewahren Sie die PCR-Röhrchen auf einem magnetischen Ständer auf, hinzufügen 250 μl HBV-Spüllösung (DWB) zu jedem Brunnen, verlassen für 2 Minuten und saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einem Unterdruckgerät ab, Achten Sie darauf, keine Rückstände zu hinterlassen.

Zugabe des Amplifikationsreagenzes (Probenverarbeitungsbereich)

• Hinzufügen 45.0 μl PCR-Mix in jede Vertiefung geben.
• Verschließen Sie den Röhrchen und umkehren Sie es um.
• Schalten Sie sanft die Perlen ab, um eine gründliche Mischung des PCR-Mix mit den Perlen zu gewährleisten.
• Sofort horizontal zentrifugieren.
• Übertragen Sie die PCR -Röhrchen in den Erkennungsbereich.
• Legen Sie sie zur Erkennung auf ein fluoreszierendes PCR -Instrument.

PCR-Amplifikation (Erfassungsbereich)

Platzieren Sie das PCR-Reaktionsgefäß im Verstärker, Stellen Sie die HBV-Negativkontrolle ein, Starke HBV-Positivkontrolle, HBV-kritische Positivkontrolle, HBV-Kalibrator ① bis ④ und die zu untersuchende Probe in der entsprechenden Reihenfolge, und legen Sie den Probennamen und die Konzentration des Kalibrators fest.

Einstellungen des Verstärkungsprogramms.

SLAN-96P als Beispiel (LightCycler® 480, SLAN-96P und Mx3005P, ABI7500 haben das gleiche Setup. Einmal eingerichtet, Speichern Sie die Datei und führen Sie das Reaktionsprogramm aus

Zugriff auf Ergebnisse

1. Beschreibung der Verstärkungskurve: Die Verstärkungskurve ist im Allgemeinen S-förmig.
2. Grundeinstellung: Abhängig von der Versuchssituation, Als Grundlinien-Einstellbereich sollte ein Abschnitt mit einem stabilen Fluoreszenzhintergrundwert ausgewählt werden.
3. Schwellenwerteinstellung: den höchsten Punkt der Amplifikationskurve der negativen Qualitätskontrolle gerade überschreiten.
4. Ergebnisanalyse: Sobald die Basislinie und die Schwellenwerte festgelegt wurden, Die Ergebnisse können analysiert werden.

Wählen Sie den FAM-Kanal aus, um die Ergebnisse für die zu testende Probe und die Qualitätskontrolle zu erhalten; Wählen Sie den HEX- oder VIC-Kanal aus, um die Ergebnisse für den internen Standard zu erhalten. (Notiz: Detaillierte Einstellungen finden Sie in den Handbüchern der verschiedenen Instrumente.)

Referenzwerte

Die untere Nachweis- und Quantifizierungsgrenze für dieses Kit beträgt 5 IE/ml, bestimmt durch Forschungstests mit Referenzwerten von ≤40 für Ziel-Ct und ≤40 für internen Standard-Ct.

Beurteilung der Gültigkeit des Experiments

1. Die Kalibratoren waren alle positiv und hatten einen linearen Korrelationskoeffizienten|R|≥0,980.
2. Eine negative Qualitätskontrolle sollte nicht nachweisbar sein und einen internen Standard-Ct-Wert ≤ haben 40.
3. Stark positive Kontrollen haben einen Ct-Wert <25 und ein Quantifizierungsbereich von (1.0-5.0) X 105 IE/ml Kritisch positive Kontrollen haben einen Ct-Wert <38 und ein Quantifizierungsbereich von (10- 100) IE/ml. Die oben genannten Anforderungen müssen im selben Experiment erfüllt sein, ansonsten, Die Testergebnisse gelten als ungültig und müssen erneut getestet werden.

Interpretation der Testergebnisse

1. Wenn das Probenergebnis ist 5-2.0 X 109 IU/ml und die Amplifikationskurve zeigt eine S-Form, während der Ct-Wert der Probe ≤40 und der Ct-Wert des internen Standards ≤40 beträgt, Das Ergebnis wird als gültig beurteilt und die positiven und entsprechenden Konzentrationswerte können direkt gemeldet werden.
2. Wenn das Probenergebnis ist >2.0 X 109 IU/ml und die Amplifikationskurve zeigt eine S-Form, die Probe Der Ct-Wert beträgt ≤40, und der interne Standard-Ct-Wert beträgt ≤40, kann direkt als HBV-DNA gemeldet werden >2.0 X 109 IE/ml. Wenn eine genaue Quantifizierung erforderlich ist, Die Probe kann auf folgende Werte verdünnt werden 2.0 X 109 IU/ml und erneut getestet
3. Wenn das Probenergebnis HBV-DNA ist <5IE/ml, Der Ct-Wert der Probe beträgt ≤40 und der Ct-Wert des internen Standards beträgt ≤40, Das Ergebnis wird als HBV-DNA-Konzentration unterhalb der unteren Nachweisgrenze des Kits angegeben; wenn der interne Standard abnormal ist (Ct >40 oder kein Wert), Das Ergebnis der Probe ist ungültig und die Ursache sollte gefunden und ausgeschlossen werden und die Probe sollte wiederholt werden (wenn das Ergebnis der Wiederholungsprüfung immer noch ungültig ist, bitte kontaktieren Sie uns). (wenn das Ergebnis der Wiederholungsprüfung weiterhin ungültig ist, bitte kontaktieren Sie uns).