核酸萃取是分子生物學和遺傳學研究的基本技術. 從生物樣本中分離 DNA 和 RNA 為研究基因表現提供了起始材料, 檢測病原體, 分析突變, 還有更多. 然而, DNA 和 RNA 結構和穩定性之間的重要差異需要針對每種核酸類型優化專門的萃取方案.
我們為什麼 萃取RNA?
RNA在細胞中扮演許多重要作用. 我們提取 RNA 的主要原因是:
- 研究基因表達 – 不同基因產生的 RNA 量可提供對細胞活動的深入了解. 定量分析 RNA 水平 聚合酶鍊式反應 RNA 定序使我們能夠了解發育過程以及細胞如何應對不斷變化的條件.
- 執行 RT-PCR – 萃取RNA可透過逆轉錄轉化為cDNA. 然後 cDNA 可用作 PCR 擴增和分析的模板.
- 用於病毒檢測 – 病毒RNA的存在表示病毒感染活躍. 從患者樣本中提取 RNA 可以診斷流感等 RNA 病毒, 冠狀病毒, 和逆轉錄病毒.
- 基因沉默實驗 – 將人工合成的 siRNA 或 miRNA 引入細胞中可以降解標靶 mRNA, 抑制特定基因. RNA萃取 驗證擊倒.
- RNA結構與功能研究 – 提取完整的 RNA 對於研究 RNA 折疊是必要的, 修改, 互動, 和酵素活性.
- 基因表現譜 – 細胞中所有RNA的集合就是其轉錄組. 分析轉錄組可深入了解全球基因調控.
RNA 和 DNA 之間影響萃取的主要區別
儘管都是核酸, RNA 和 DNA 具有重要的區別，因此其萃取方法也有所不同:
1. RNA 的化學穩定性不如 DNA
- RNA中的核糖含有羥基 (-哦) 附於2′ 位置. 這使得磷酸二酯主鏈更容易自發性水解.
- RNA 也容易被核糖核酸酶降解 (核糖核酸酶) 酵素. RNase 穩定且不易變性, 極少量的RNA會迅速斷裂.
- 相比之下, DNA缺少2′ 羥基且不被 RNase 靶向. 這使得 DNA 在化學上比 RNA 更穩定.
2. 萃取的最佳 pH 值不同
- DNA 在中性或微鹼性 pH 值的萃取過程中最為穩定 7-8.
- 然而, pH值高於 7 核糖 2 促進 RNA 鹼性水解′-哦. 低於 pH 值的酸性條件 5 RNA 需要.
- 最佳 pH 值的差異在同時提取兩者時提出了關鍵挑戰.
3. 細胞豐度和樣品要求
- 每個細胞內存在許多基因組 DNA 拷貝, 允許輕鬆分離微克量.
- 萃取的不同 RNA 類型庫取決於組織特異性表現水平. 通常會獲得納克量.
- 因此, RNA 需要更仔細的處理和優化才能完整萃取微量的 RNA.
RNA 和 DNA 萃取方案的逐步比較
考慮到這些關鍵差異, 讓我們來看看 RNA 和 DNA 萃取的每個步驟所採用的專門方法:
1. 樣品破碎均質化
- 對於 DNA 和 RNA, 首先需要細胞裂解來破壞細胞膜並釋放核酸. 方法包括透過研磨冷凍組織樣本進行物理破壞.
- 然而, 在此步驟中，必須立即將 RNase 抑制劑添加到 RNA 樣本中，以滅活釋放的豐富核糖核酸酶. 不使用 DNA 抑制劑.
2. 從細胞成分分離核酸
- 用於 DNA 萃取, 添加濃鹽溶液會導致蛋白質沉澱，同時使 DNA 溶解.
- 對於RNA, 離液鹽如濃縮鹽 異硫氰酸胍 快速使蛋白質變性，同時使 RNase 失去活性.
- 使用苯酚和氯仿進行有機萃取有助於將釋放的核酸與蛋白質分離, 脂質, DNA 和 RNA 的碳水化合物.
3. 核酸的沉澱與回收
- 乙醇或異丙醇沉澱從水溶液中分離 DNA 或 RNA. 微鹹條件提高 RNA 沉澱效率.
- 由於 RNA 量極小, 糖原或線性丙烯醯胺等共沉澱劑用於視覺沉澱 RNA.
- 在特定緩衝條件下，高分子量 DNA 容易沉澱，而 RNA 仍溶解在乙醇中. 這使得他們的分離.
4. 去除污染物
- DNA 製備物以 RNase 處理以去除共純化的 RNA 片段.
- 同樣地, 無 RNase 的 DNase 消化消除了 RNA 萃取物中的微量 DNA.
- 可以使用旋轉柱進行進一步純化, 苯酚萃取, 或沉澱步驟以消除鹽, 酵素, 碳水化合物, 和其他污染物.
評估數量, 純度, 和誠信
嚴格的品質控制對於確保萃取的 DNA 和 RNA 適用於敏感的分析技術是必要的:
量化核酸水平
- 紫外線吸收率 260 nm 使用分光光度計透過比爾-朗伯定律估算濃度.
- 使用染料進行螢光定量 SYBR Green I 比 UV 吸光度更靈敏、更準確.
評估純度
- A260/A280 比率可檢測蛋白質或苯酚污染. 純 DNA/RNA 的比率約為 1.8.
- 其他波長比（例如 A260/A230）可以檢測多醣或離液污染.
評估 RNA 完整性
- 電泳揭示 RNA 是否完整或降解. 清晰的 28S 和 18S 核醣體 RNA 條帶代表完整的 RNA.
- RNA 完整性號 (環網) 演算法根據電泳圖對 RNA 品質進行客觀評分.
- 降解的 RNA 顯示為塗片而不是離散條帶，不適合下游檢測.
結論
雖然 DNA 和 RNA 萃取有一些共同的原則, RNA 更容易降解，需要特定步驟才能完整分離. 了解這些關鍵差異使研究人員能夠獲得用於敏感下游應用的高品質核酸. 透過練習, 萃取方案可以微調以獲得最佳 RNA 和 DNA純化 來自不同的生物來源.
常見問題解答
為什麼需要 RNase 抑制劑?
RNase 在萃取過程中快速降解 RNA. RNase 抑制劑不可逆地結合併滅活這些酶, 保留完整的RNA.
提取 RNA 的最佳組織是什麼?
RNA 在肝臟等代謝活躍的組織中含量豐富, 腎臟, 或活躍分裂的細胞. 這些提供高產量. 胰臟或皮膚等 RNase 水平較高的組織更具挑戰性.
RNA萃取後可保存多久?
分離的 RNA 應保存在 -80°C 的無核酸酶水中. 理想條件下, RNA 可能在一年內保持完整，但隨著時間的推移仍然會發生一些降解.
提取套件的選擇有影響嗎?
是的, 裂解緩衝液和 RNase 抑制劑等試劑盒成分會影響 RNA 質量. 某些試劑盒對於 qPCR 或 RNA 定序等特定應用表現較好.
