介紹
聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應) 1980年代發明的醫學研究徹底改變了醫學研究. 該技術利用自然的DNA複製過程來快速擴大特定的遺傳序列以進行進一步研究. PCR為遺傳學研究和臨床診斷開闢了新的可能性.
一種更先進的PCR，稱為實時PCR, 後來建立在這一發現之上. 實時PCR提供了其他功能，使其適用於標準PCR失敗的某些應用.
了解何時使用每種方法使研究人員能夠優化實驗和臨床醫生提供更好的患者護理.
什麼是傳統的PCR，為什麼重要的是
卡里·穆利斯（Kary Mullis）沿著月光燈高速公路行駛時首先發現了PCR. 這種諾貝爾獎獲獎技術利用了自然的DNA複製過程，以指數級在體外擴增靶向遺傳序列.
PCR使科學家能夠通過其他方式研究微小的遺傳樣本. 它也提供了快速, 負擔得起的DNA克隆實驗的替代方案，該實驗耗時數週或幾個月.
傳統PCR如何工作？
PCR由重複的溫度週期組成，以促進DNA變性, 底漆退火, 和序列通過熱穩定DNA聚合酶延伸. 後 30-40 週期, 存在足夠的副本進行分析和下游應用.
該過程涉及三個關鍵步驟:
●變性: 加熱將DNA雙螺旋分為單鏈
●退火: 冷卻允許底漆與其互補序列結合
●擴展: DNA聚合酶使用引物合成新鏈
然後重複該週期, 目標DNA副本的數量大約翻倍. 後 30+ 週期, 有超過十億份.
您可以使用傳統的PCR作為什麼?
PCR由於其可靠性而開闢了遺傳研究和臨床診斷的新可能性, 適應性, 和簡單.
此PCR的用途包括:
●檢測基因突變
●克隆和測序DNA
●分析法醫證據
●診斷病原體和疾病
傳統PCR有什麼限制?
而傳統的PCR定性檢測目標序列, 它缺乏量化功能. 終點檢測方法僅確認存在與不存在擴增的存在. 研究人員缺乏用於定量測量諸如應用的遺傳生物標誌物的工具:
●精確的基因表達分析
●檢測癌症中最小殘留疾病
●感染的病毒負荷監測
●高通量遺傳篩查
什麼是實時PCR，什麼時候開發?
實時定量PCR, 也稱為定量PCR (定量PCR), 最終在1990年代初給PCR帶來了絕對的DNA定量功能.
專用儀器檢測到每個溫度週期的DNA結合染料或序列特異性探針的熒光. 該軟件生成用於精確量化啟動DNA的實時擴增圖.
實時PCR如何工作?
實時PCR結合了熒光報告基因染料或序列特異性探針以在擴增過程中實現DNA定量. 關鍵步驟是:
●熒光標籤插入或雜交以擴增DNA
●專業儀器檢測每個週期的熒光
●軟件生成放大圖
●定量分析計算絕對起始DNA水平
因此，通過監測整個指數擴增過程中的熒光, 實時PCR促進敏感定量檢測.
它提供了什麼優勢?
雖然標準PCR定性檢測遺傳序列, 放大過程中的實時PCR可以通過熒光量化初始量.
此關鍵區別使實時PCR理想:
●精確測量基因表達
●檢測最小殘留疾病
●病毒負荷監測
●診斷篩查
●高通量遺傳分析
實時PCR如何啟用定量檢測？
實時PCR通過使用與擴增的DNA鏈相互作用的熒光報告系統來促進精確的DNA定量. 有兩種類型:
- 非特異性DNA染料
熒光染料喜歡 SYBR 綠色可以在任何雙鏈DNA中結合併插入. 隨著放大過程在PCR期間成倍地進行, 更標記的DNA會累積，熒光強度會按比例增加. 專業儀器在每個週期後監視此強度. 通過確定熒光超過背景的循環 (CQ), 該軟件計算初始DNA的絕對數量
- 序列規格探針
序列特異性探針（例如Taqman探針和分子信標）僅結合和量化目標DNA序列. 這些探針含有熒光記者染料和淬滅劑分子. 當綁定到目標時, 記者熒光被淬滅. 在放大過程中, 聚合酶活性釋放探針, 從淬火器中隔離記者並發出熒光.
實時PCR如何比傳統PCR更好?
實時PCR可以提高傳統PCR的敏感性, 特異性, 和速度:
●通過熒光量化初始DNA水平
●提高靈敏度和準確性
●沒有PCCR步驟的更快的時間
●帶有多孔板的更高吞吐量
●自動化提高了可重複性
因此，對於需要敏感量化或快速分析的任何應用, RT PCR在常規PCR上脫穎而出.
比較傳統的PCR和實時PCR
這是傳統PCR與實時PCR的比較，可以幫助您在兩個傳統的PCR和實時PCR之間做出決定 :
| 特徵 | 傳統PCR | 實時定量PCR |
| 原則 | 目標DNA序列的指數擴增 | 放大和同時定量 |
| 定量 | 定性 (是/否檢測) | 定量 (絕對數量) |
| 檢測方法 | 擴增後凝膠電泳或熒光檢測 | 放大過程中的熒光監測 |
| 反應監測 | 僅終點 | 即時的, 每個擴增週期之後 |
| 速度 | 緩和, 需要PCR後 加工 |
由於實時數據獲取而迅速 |
| 靈敏度 | 高的 | 很高 – 可以檢測 1-10 副本 |
| 特異性 | 高的 | 由於序列特異性探針非常高 |
| 再現性 | 高的 | 自動液體處理非常高 |
| 吞吐量 | 緩和 | 高的, 使用多孔板 |
| 儀器 | 熱循環儀 | 實時熱循環儀 + 電腦 |
| 主要應用 | 基因克隆, 基因分型, 突變檢測 | 基因表達分析, 診斷, 病毒定量 |
大多數臨床醫生在傳統PCR和實時PCR之間建議什麼?
標準和實時PCR都通過實現敏感的遺傳分析徹底改變了研究和診斷. 然而, 許多科學家和臨床醫生建議使用傳統PCR的RT PCR用於應用:
●DNA水平的絕對定量
●臨床環境的快速結果
●高通量測試功能
●最大檢測靈敏度
用於定性檢測, 傳統PCR是最好的方法. 但是RT PCR的精確量化和速度使其成為遺傳學研究和分子診斷的必不可少的工具.
最終想法
兩種方法都提供敏感和特定的DNA擴增, 實時PCR提供其他功能，例如絕對量化, 更高的吞吐量, 提高速度, 敏感性使其非常適合研究和分子診斷中的某些應用. 選擇主要取決於對量化的需求與簡單的定性檢測.
