導入
ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 1980年代に発明されて医学研究に革命をもたらした. この技術は、自然な DNA 複製プロセスを利用して、さらなる研究のために特定の遺伝子配列を迅速に増幅します。. PCR は遺伝学研究と臨床診断に新たな可能性を切り開きました.
リアルタイム PCR と呼ばれる、より高度な形式の PCR, 後にこの発見に基づいて構築されました. リアルタイム PCR は、標準 PCR が失敗する特定のアプリケーションに最適な追加機能を提供します。.
各方法をいつ使用するかを理解することで、研究者は実験を最適化し、臨床医はより良い患者ケアを提供できるようになります。.
従来型 PCR とは何ですか?なぜ重要ですか?
キャリー・マリスが初めてPCRを発見したのは、月明かりに照らされた高速道路を運転中にだった. ノーベル賞を受賞したこの技術は、自然の DNA 複製プロセスを利用して、標的遺伝子配列を in vitro で指数関数的に増幅します。.
PCR により、科学者は他の手段では検出できない微小な遺伝子サンプルを研究できるようになりました. また、迅速な, かつては数週間から数か月かかっていた DNA クローン作成実験に代わる手頃な価格の代替手段.
従来の PCR はどのように機能しますか?
PCR は DNA の変性を促進するために温度サイクルを繰り返すことで構成されます, プライマーアニーリング, 熱安定性 DNA ポリメラーゼによる配列拡張. 後 30-40 サイクル, 分析と下流のアプリケーションに十分なコピーが存在します.
このプロセスには 3 つの重要なステップが含まれます:
● 変性: 加熱によりDNA二重らせんが一本鎖に分離されます。
●アニーリング: 冷却により、プライマーは相補的配列に結合できるようになります。
●拡張機能: DNAポリメラーゼはプライマーを使用して新しい鎖を合成します
このサイクルが繰り返されます, ターゲット DNA のコピー数はラウンドごとに約 2 倍になります. 後 30+ サイクル, 10億部以上存在する.
従来の PCR は何に使用できますか?
PCR はその信頼性により、遺伝子研究と臨床診断に新たな可能性を切り開きました, 適応力, そしてシンプルさ.
この PCR の用途には次のものがあります。:
● 遺伝子変異の検出
● DNA のクローニングと配列決定
● 法医学的証拠の分析
● 病原体や病気の診断
従来の PCR にはどのような限界があるのか?
従来の PCR は標的配列を定性的に検出しますが、, 定量化機能が欠けている. エンドポイント検出方法は、増幅の有無を確認するだけです. 研究者には、次のような用途の遺伝バイオマーカーを定量的に測定するツールがありませんでした。:
● 正確な遺伝子発現解析
● がんの微小残存病変の検出
● 感染症のウイルス量モニタリング
● ハイスループット遺伝子スクリーニング
リアルタイム PCR とは何ですか?いつ開発されましたか??
リアルタイムPCR, 定量的PCRとも呼ばれます (qPCR), 1990 年代初頭、ついに PCR に絶対的な DNA 定量機能が導入されました。.
特殊な機器が各温度サイクルで DNA 結合色素または配列特異的プローブからの蛍光を検出します. ソフトウェアは、開始 DNA を正確に定量するために使用されるリアルタイム増幅プロットを生成します。.
リアルタイム PCR の仕組み?
リアルタイム PCR には、蛍光レポーター色素または配列特異的プローブが組み込まれており、増幅中の DNA 定量が可能になります。. 重要な手順は次のとおりです:
● 蛍光ラベルが挿入またはハイブリダイズして DNA を増幅します。
● 専用機器が各サイクルで蛍光を検出
● ソフトウェアは増幅プロットを生成します
● 定量分析により、絶対的な開始 DNA レベルが計算されます。
したがって、指数関数的増幅プロセス全体を通じて蛍光をモニタリングすることにより、, リアルタイム PCR により高感度の定量的検出が容易になります.
どのようなメリットがあるのか?
標準的な PCR は遺伝子配列を定性的に検出しますが、, 増幅中のリアルタイム PCR により、蛍光によって初期量が定量化されます。.
この重要な違いにより、リアルタイム PCR は次の用途に最適です。:
● 遺伝子発現を正確に測定
● 最小限の残存病変の検出
●ウイルス量のモニタリング
● 診断スクリーニング
● ハイスループットの遺伝子解析
リアルタイム PCR はどのようにして定量的検出を可能にするのですか?
リアルタイム PCR は、増幅する DNA 鎖と相互作用する蛍光レポーター システムの使用により、正確な DNA 定量を容易にします。. 大きく分けて2つのタイプがあります:
- 非特異的 DNA 色素
蛍光染料のようなもの SYBR 緑色はあらゆる二本鎖 DNA に結合し、その中に挿入できます。. PCR中は増幅が指数関数的に進行するため、, より多くの標識された DNA が蓄積し、蛍光強度が比例して増加します。. 専用の機器が各サイクル後にこの強度を監視します. 蛍光がバックグラウンドを超える周期を決定することにより (Cq), ソフトウェアは初期 DNA の絶対量を計算します。
- 配列特異的プローブ
TaqMan プローブや分子ビーコンなどの配列特異的プローブは、標的 DNA 配列のみに結合して定量します。. これらのプローブには、蛍光レポーター色素とクエンチャー分子が含まれています。. ターゲットにバインドされている場合, レポーターの蛍光が消光される. 増幅中, ポリメラーゼ活性によりプローブが放出される, クエンチャーからレポーターを分離し、蛍光を発します。.
リアルタイム PCR は従来の PCR よりどのように優れているのか?
リアルタイム PCR は従来の PCR の感度を向上させます, 特異性, そしてスピード:
● 蛍光により初期 DNA レベルを定量化します。
● 感度と精度の向上
● PCR 後のステップが不要で結果が得られるまでの時間が短縮
● マルチウェルプレートによる高いスループット
● 自動化により再現性が向上
したがって、高感度の定量化または迅速な分析を必要とするあらゆるアプリケーションに最適です。, rt PCR は従来の PCR よりも優れています.
従来の PCR とリアルタイム PCR の比較
従来の PCR とリアルタイム PCR の比較は、従来の 2 つの PCR とリアルタイム PCR のどちらを使用するかを決定するのに役立ちます。 :
| 特徴 | 従来の PCR | リアルタイムPCR |
| 原理 | 標的DNA配列の指数関数的増幅 | 増幅と同時定量 |
| 定量化 | 定性 (はい/いいえ検出) | 定量的 (絶対量) |
| 検出方法 | 増幅後のゲル電気泳動または蛍光検出 | 増幅中の蛍光モニタリング |
| 反応モニタリング | エンドポイントのみ | リアルタイム, 各増幅サイクル後 |
| スピード | 適度, PCR後が必要 処理 |
リアルタイムのデータ取得により高速化 |
| 感度 | 高い | 非常に高い – 検出できる 1-10 コピー |
| 特異性 | 高い | 配列特異的なプローブにより非常に高い |
| 再現性 | 高い | 自動液体処理により非常に高い |
| スループット | 適度 | 高い, マルチウェルプレートを使用 |
| 計装 | サーマルサイクラー | リアルタイムサーマルサイクラー + コンピューター |
| 主な用途 | 遺伝子クローニング, ジェノタイピング, 突然変異の検出 | 遺伝子発現解析, 診断, ウイルスの定量化 |
ほとんどの臨床医は従来の PCR とリアルタイム PCR のどちらを推奨しますか?
標準 PCR とリアルタイム PCR は両方とも、高感度の遺伝子分析を可能にすることで研究と診断に革命をもたらしました。. しかし, 多くの科学者や臨床医は、必要な用途には従来の PCR よりも rt PCR を推奨しています。:
● DNA レベルの絶対定量化
● 臨床現場での迅速な結果
● ハイスループットのテスト機能
●最大検出感度
定性的検出用, 従来の PCR が最良の方法である. しかし、rt PCR の正確な定量化と速度により、rt PCR は遺伝学研究と分子診断にわたって不可欠なツールとなっています。.
最終的な考え
どちらの方法でも高感度で特異的な DNA 増幅が可能です, リアルタイム PCR は絶対定量などの追加機能を提供します, より高いスループット, 速度の増加, 研究や分子診断における特定の用途に最適な感度と感度. 選択は主に、定量化の必要性と単純な定性的検出の必要性によって決まります。.
