Solarbio ออกซิไดซ์กลูตาไธโอน (จีเอสเอสจี) ชุดทดสอบเนื้อหา

กลูตาไธโอนออกซิไดซ์ (จีเอสเอสจี) ชุดทดสอบเนื้อหา

บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท

หมายเลขแค็ตตาล็อก: พ.ศ. 1185

ขนาด:100ที/96ส

ส่วนประกอบ:

รีเอเจนต์ I:100 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. รีเอเจนต์ II: 130 ไมโครลิตร×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. รีเอเจนต์ III: 20 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. รีเอเจนต์ IV:2.5 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ V: ผง×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. ละลายไปกับ 2.5 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นเมื่อจะใช้สารละลาย, แล้วแยกเป็นแพ็คเกจเล็กๆ, ใหญ่ที่ -20 ℃.

รีเอเจนต์ VI:12.5 ไมโครลิตร×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. เตรียม Reagent VI และน้ำกลั่นตามขนาดตัวอย่างในอัตราส่วน 1:20 (วี: วี) ก่อนใช้งาน.

มาตรฐาน: ผง 10 มก.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รายละเอียดสินค้า

กลูตาไธโอนออกซิไดซ์(จีเอสเอสจี) คือกลูตาไธโอนในรูปแบบออกซิไดซ์ (จีเอสเอช), หรือที่เรียกว่าไดไธโอนกลูตาไธโอน, เกิดจากการออกซิเดชั่นของกลูตาไธโอน 2 โมเลกุล. GSSG ถูกรีดิวซ์เป็น GSH โดยกลูตาไธโอนรีดักเตส, ร่างกายส่วนใหญ่จึงอยู่ในสภาพที่ลดลง. การกำหนดปริมาณ GSH และ GSSG และอัตราส่วนของ GSH/GSSG ในเซลล์สามารถสะท้อนสถานะรีดอกซ์ของเซลล์. ชุดนี้ใช้ปฏิกิริยาของกลูตาไธโอนและ 5, 5′-กรดไดไทโอบิส-2-ไนโตรบีโนอิก (ดีทีเอ็นบี) เพื่อผลิต 5-ไทโอ-2- กรดไนโตรเบนโซอิก. 5-ไทโอ-2- กรดไนโตรเบนโซอิกมีการดูดกลืนแสงมากที่สุดที่ความยาวคลื่นของ 412 นาโนเมตร, และ 2-Vinylpyridine ยับยั้งการลดกลูตาไธโอนในตัวอย่างดั้งเดิม, จากนั้นใช้กลูตาไธโอนรีดักเตสเพื่อลด GSSG เป็น GSH, การกำหนดเนื้อหาของกลูตาไธโอนออกซิไดซ์.

ข้อกำหนดทางเทคนิค

ขีดจำกัดการตรวจจับขั้นต่ำ：3.211 มก./มล

ช่วงเชิงเส้น：3.9-125 มก./มล

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้.

ความสมดุลเชิงวิเคราะห์, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, เครื่องหมุนเหวี่ยงแช่เย็น, อ่างน้ำ, ปิเปตแบบปรับได้, เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท, คิวเวทท์แก้วไมโคร/แผ่นก้นแบน 96 หลุม.

ขั้นตอน

ฉัน. ตัวอย่าง การตระเตรียม

1. 1. ตัวอย่างเนื้อเยื่อ

ล้างทิชชู่สดด้วย PBS สองครั้ง, จากนั้นเพิ่ม 0.1 กรัมของตัวอย่างลงในโฮโมจีไนเซอร์ (โฮโมจีไนเซอร์ถูกล้างด้วยรีเอเจนต์ I แล้ววางบนน้ำแข็งก่อนใช้งาน). เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของรีเอเจนต์ I (สัดส่วนของเนื้อเยื่อและรีเอเจนต์สามารถรักษาให้คงที่ได้), บดน้ำแข็งจนสุด (การใช้ไนโตรเจนเหลวจะมีผลการบดที่ดีกว่า). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×g และ 4℃ สำหรับ 10 นาที, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (ส่วนเหนือตะกอนสามารถเก็บไว้ที่ -80°C ได้ 10 วัน)

2. ตัวอย่างเลือด

พลาสมา: ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ 600 ×g และ 4℃ สำหรับ 10 นาที. การดูดซับพลาสมาส่วนบนลงในอีกหลอดหนึ่งจะเติมด้วยรีเอเจนต์ I ที่มีปริมาตรเท่ากัน. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×g และ 4℃ สำหรับ 10 นาที, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (ส่วนเหนือตะกอนสามารถเก็บไว้ที่ -80°C เป็นเวลา 10 วัน)

เซลล์เม็ดเลือด:ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ 600 ×g และ 4℃ สำหรับ 10 นาที. การทิ้งพลาสมาส่วนบน, ล้างด้วยระดับเสียงแหลมของ PBS สำหรับ 3 ครั้ง (ผสมเซลล์เม็ดเลือดกับเครื่องหมุนเหวี่ยง PBS ที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 นาที), เพิ่มปริมาตรรีเอเจนต์ I ที่เท่ากัน. หลังจากผสมแล้ว, วางไว้ที่ 4 ℃สำหรับ 10 นาที. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (ส่วนเหนือตะกอนสามารถเก็บไว้ที่ -80°C ได้ 10 วัน)

3. ตัวอย่างเซลล์

เซลล์เก็บเกี่ยวไม่ควรน้อยกว่า 106 จากนั้นล้างด้วย PBS สองครั้ง (ผสมเซลล์กับเครื่องหมุนเหวี่ยง PBS ที่ 600×g สำหรับ 10 นาที), ผสมเซลล์ที่ตกตะกอนด้วยปริมาตรของ PBS 3 ครั้ง. การแช่แข็งและละลายซ้ำ 2-3 ครั้ง (แนะนำให้แช่แข็งในไนโตรเจนเหลว, ละลายในอ่างน้ำอุณหภูมิ 37°C). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (ส่วนเหนือตะกอนสามารถเก็บไว้ที่ -80°C ได้ 10 วัน)

ครั้งที่สอง. ขั้นตอน

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลทสำหรับ 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 412 นาโนเมตร, ตั้งตัวนับเป็นศูนย์ด้วยการกลั่น
2. เปิดฮีต Reagent II ในอ่างน้ำเพื่อ 30 นาที: 37℃ (เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) หรือ 25 ℃ (สายพันธุ์อื่น).
3. การเจือจางมาตรฐาน: ละลายมาตรฐานด้วย 1 มิลลิลิตรของน้ำกลั่น (4℃) ถึงความเข้มข้นของ 10 มก./มล. ใช้สารละลายที่เหมาะสมเพื่อเตรียมความเข้มข้นมาตรฐานที่ 125ไมโครกรัม/มิลลิลิตร、 5มก./มล、31.25มก./มล、15.625มก./มล、7.8125มก./มล、3.90625ไมโครกรัม/มิลลิลิตรLand0ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (สารเจือจางคือรีเอเจนต์ I ที่เจือจางสิบเท่า).

4. เพิ่ม 20 ไมโครลิตรของสารมาตรฐานหรือตัวอย่างเจือจาง 0.5 หลอดหมุนเหวี่ยงขนาดมล, เพิ่ม 1 μL ของรีเอเจนต์ II, ฟักตัวที่ 37 ℃ สำหรับ 30 นาทีหลังจากผสม.
5. สร้างเส้นโค้งมาตรฐาน

หลังจากการฟักตัว, เพิ่ม 140 μL ของรีเอเจนต์ III, 20 μL ของรีเอเจนต์ IV, 20μL ของรีเอเจนต์ V, และ 2 μL ของ Reagent VI ไปยังหลอดมาตรฐานตามลำดับ. หลังจากผสมอย่างรวดเร็ว, การดูดกลืนแสง A1 และ A2 ของ 30 ทราย 150 s ตามลำดับถูกวัดที่ 412 นาโนเมตร. การดูดซับ (A2-A1) คืออับซิสซา (x) และสมาธิเป็นที่ตั้ง (ย), ทำให้โค้งมาตรฐาน.

เพิ่ม 140 μL ของรีเอเจนต์ III, 20 μL ของรีเอเจนต์ IV, 20 μL ของรีเอเจนต์ V, และ 2 μLof Reagent VI ไปยังหลอดตัวอย่างตามลำดับ. หลังจากผสมอย่างรวดเร็ว, การดูดกลืนแสง A1 และ A2 ของ 30 ทราย 150 s ตามลำดับถูกวัดที่ 412 นาโนเมตร, ∆A= A2- A1.

สาม. การคำนวณ

ตามเส้นโค้งมาตรฐาน, ตัวอย่าง ΔA ลงในสูตร (x), คำนวณความเข้มข้นตัวอย่างของ y

(มก./มล).

• ความเข้มข้นของโปรตีน

จีเอสเอสเอช (มก / มก. โปรต)=y×Vrv۞Vrv۞Cpr =yCpr

• น้ำหนักตัวอย่าง

จีเอสเอสเอช (ไมโครกรัม/กรัม)= y×Vrvτ(วรววววสว×ว)= y۞W

• เซลลาเมาท์

จีเอสเอสเอช (มก /106 เซลล์)= y×Vrvτ(วีอาร์วีวอเตอร์วีเอสวี×เอ็น)= y۞N

• ปริมาณสารละลาย

จีเอสเอสเอช (มก / มล)= y×Vrv/Vs= 2y

เอ็น: จำนวนเซลล์,106；

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด, 0.203 มล；

เทียบกับ: ปริมาตรของส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเติมเข้าไปในระบบปฏิกิริยา, 20 ไมโครลิตร=0.02 มล； ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;

ซีพีอาร์: ความเข้มข้นของโปรตีนเหนือตะกอน, มก./มล.

หมายเหตุ:

1. ตัวอย่างจะต้องทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยสมบูรณ์. หากไม่สามารถทำการทดสอบให้แล้วเสร็จได้ชั่วคราว, สามารถเก็บไว้ที่ -80 ℃.
2. หากเนื้อหาของเนื้อหา GSSG ในกลุ่มตัวอย่างไม่แน่นอน, การไล่ระดับสีหลายๆ แบบสามารถเจือจางก่อนการวัดได้.
3. วิธีนี้ใช้อัตราปฏิกิริยาของเอนไซม์ในการคำนวณความเข้มข้นของสารตั้งต้นและอ่านค่าได้อย่างแม่นยำที่สุด 30 และ 150
4. รีเอเจนต์ I มีสารตกตะกอนโปรตีน, ส่วนลอยเหนือตะกอนไม่สามารถใช้ในการวัดความเข้มข้นของโปรตีนได้. หากจำเป็นต้องกำหนดปริมาณโปรตีน, เอาเนื้อเยื่ออีกอัน.

อ้างอิง:

• อัลเพิร์ต เอ เจ, กิลเบิร์ต เอช เอฟ. การตรวจหากลูตาไธโอนที่ถูกออกซิไดซ์และรีดิวซ์ด้วยปฏิกิริยาหลังการรีไซเคิล[เจ]. ชีวเคมีวิเคราะห์, 1985, 144(2):553-562.
• โอเวนส์ ซี ดับเบิลยู ไอ, Belcher R วิธีการวัดสีแบบไมโครสำหรับตรวจวัดกลูตาไธโอน[เจ]. วารสารชีวเคมี, 1965, 94(3): 705.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง：

BC1170/ BC1175 ชุดทดสอบกลูตาไธโอนแบบลดปริมาณ (GSH)

BC1190/ BC1195 ชุดทดสอบกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส

BC0350/ BC0355 กลูตาไธโอน S-ทรานส์เฟอเรส(ภาษีสินค้าและบริการ) ชุดทดสอบกิจกรรม

BC1160/ BC1165 กลูตาไธโอน รีดักเตส (GR) ชุดทดสอบ