1. ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์
| ข้อมูลจำเพาะ | 50ต | 100ต |
| แมว. เลขที่. | SN0237 | SN0238 |
| คอลัมน์สกัดดีเอ็นเอ (ชุด) | 50 (ชุด) | 100 (ชุด) |
| Reagent Buffer E1 | 50มล | 2x50ml |
| Reagent Buffer E2 | 30มล | 2x30ml |
| รีเอเจนต์บัฟเฟอร์ B | 20มล | 2x20ml |
| รีเอเจนต์บัฟเฟอร์ C | 30 มล | 30 มล |
| ล้างบัฟเฟอร์ 1 | 15 มล | 2 × 15 มล |
| บัฟเฟอร์การชะล้าง | 20 มล | 20 มล |
| โปรตีนเค | 1มล | 1มล |
| อาร์เนส เอ | 1มล | 1มล |
| คู่มือการใช้งาน | 1 | 1 |
2. พื้นที่จัดเก็บ
This kit can be stored at room temperature (15-25℃) in dry conditions for 12 เดือน. The DNA extraction purification columns can be stored in a cool and dry environment for 1 ปี. โปรตีน K และ อาร์เนส เอ มีสารกันบูด, จึงสามารถขนส่งได้ที่อุณหภูมิห้อง, แต่สำหรับการจัดเก็บระยะยาว, ควรเก็บไว้ที่ -20 ℃. Reagent buffers E1/E2 should be stored at 4℃.
3. คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์
3.1 ชุดรีเอเจนต์นี้มีไว้สำหรับการวิจัยอณูชีววิทยา และไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยหรือการรักษาโรค.
3.2 ส่วนประกอบบางอย่างในชุดรีเอเจนต์มีสารระคายเคือง. แนะนำให้ใช้มาตรการป้องกัน เช่น การสวมชุดป้องกันและแว่นตา.
3.3 ระหว่างการใช้งานชุดรีเอเจนต์นี้, เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, พีบีเอส,น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, และผู้ใช้ต้องเตรียมท่อ EP.
4. ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์
The Mitochondrial Genome การทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ Kit offers a rapid and efficient method for purifying DNA from animal tissues and cell cultures. Widely used in both animal tissue and cell cultures, this kit consists of two parts. The first part involves rapid collection of high-purity animal tissue and cell mitochondria using gradient centrifugation. The second part utilizes a column-based method for quick extraction of mitochondrial DNA without the need for toxic reagents like phenol-chloroform. DNA ที่สกัดออกมาสามารถนำมาใช้ได้โดยตรง พีซีอาร์, การซับใต้, และแอพพลิเคชั่นอื่น ๆ.
5. หลักและวิธีการทดลอง
6. กระบวนการสกัด
ก่อนเริ่มการทดลอง:
ก. Reagent Buffers B and C tend to precipitate under low-temperature conditions. It is recommended to heat them at 65°C for 5 minutes until the precipitates dissolve before normal use.
บี. Before using ล้างบัฟเฟอร์ 1, follow the instructions on the reagent bottle label to add the specified amount of absolute ethanol. แล้ว, check the label to indicate that ethanol has been added.
ค. บัฟเฟอร์การชะล้างคือ 0.1x โซลูชัน TE with minimal EDTA content. หาก EDTA ส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อไป, it is suggested to use sterile deionized water instead of the elution buffer.
ดี. Mitochondrial Collection: The first part involves collecting mitochondria, where centrifugation is crucial. During the extraction process, centrifugal force is expressed in ‘g’. Most centrifuges have a rpm/g conversion mode, so please pay attention.
- การประมวลผลตัวอย่าง:
ก. Take cell culture medium, centrifuge at 1000g for 1 minute to collect cells. Try to remove as much supernatant as possible. เพิ่ม 1ml PBS (PH7.9) to wash the cells, centrifuge to collect them, จากนั้นเพิ่ม 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 to fully suspend the cells and homogenize rapidly 5-10 ครั้ง.
บี. Cut tissues not exceeding 200 mg into small pieces, เพิ่ม 1ml PBS (PH7.9) for washing and absorb excess liquid with filter paper. เพิ่ม 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 and grind in an ice bath about 20 ครั้ง.
2. Transfer the liquid mixture to a centrifuge tube, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 4℃, 1000กรัมสำหรับ 5 นาที, and transfer the supernatant to a new centrifuge tube.
(บันทึก: There may be precipitates in this transferred supernatant. For obtaining high-purity mitochondria, it is recommended to centrifuge and transfer the supernatant during step 2.)
- Transfer the supernatant obtained in the previous step to a new centrifuge tube, centrifuge at 12000g, 4℃ สำหรับ 10 นาที, and discard the supernatant.
(บันทึก: After this step, mitochondria will precipitate at the bottom of the tube.)
- Recommended step: เพิ่ม 5ml Reagent Buffer E2 to the mitochondrial pellet, resuspend it, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 4℃, 1000กรัมสำหรับ 5 นาที, ถ่ายโอน supernatant ไปยังหลอดเครื่องหมุนเหวี่ยงใหม่, then centrifuge at 12000g, 4℃ สำหรับ 10 นาที, ทิ้งส่วนเหนือตะกอน, and obtain high-purity mitochondrial precipitates at the tube bottom.
(บันทึก: Mitochondria collection at this step is complete. You may interrupt the experiment and store mitochondria at -70℃.)
Second Part: Isolation and Purification of Mitochondrial DNA
- เพิ่ม 280μlของบัฟเฟอร์รีเอเจนต์ b, 10μl ของ RNase A, and 10μl of Proteinase K to the centrifuge tube containing mitochondria. Thoroughly invert to mix, digest at 65℃ สำหรับ 5 นาที.
- เพิ่ม 300μlของสารรีเอเจนต์บัฟเฟอร์ C to the lysate and mix well. หากมีการตกตะกอนสีขาวปรากฏขึ้น, it can be left undisturbed; its disappearance will not affect subsequent experiments.
- เพิ่ม 300ไมโครลิตรของเอทานอลสัมบูรณ์ and mix thoroughly. It may cause precipitation, แต่มันจะไม่ส่งผลกระทบต่อการทดลองครั้งต่อไป.
- Transfer the obtained liquid to the DNA extraction purification column (ชุด) (ประมาณ 650~700μl ในแต่ละครั้ง). Centrifuge at more than 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะที่รวบรวมไว้, and re-insert the collection tube into the purification column for the next step.
- วางคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์สำหรับการสกัด DNA (ชุด) ลงในคอลเลกชัน, เพิ่ม 300μl ของ Wash Buffer 1, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะ, และใส่คอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์สำหรับการสกัด DNA อีกครั้ง (ชุด) ลงในท่อเพื่อขั้นตอนต่อไป.
(บันทึก: ยืนยันว่ามีการเพิ่มเอทานอลสัมบูรณ์ในการล้างบัฟเฟอร์ 1.)
- เพิ่ม 400μl ของ Wash Buffer 1 ไปยังคอลัมน์การสกัดดีเอ็นเอ (ชุด), เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก) สำหรับ 2 นาที. Extend centrifugation time appropriately for a drier membrane.
- วางคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์สำหรับการสกัด DNA (ชุด) in a new centrifuge tube, open the cap, and incubate at 65℃ สำหรับ 2 นาที. Extend this step as needed to evaporate ethanol completely to prevent residual ethanol from affecting downstream experiments.
- Drip-suspend 50-100μl ของบัฟเฟอร์การชะล้าง ลงบนเมมเบรน, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 นาที.
(บันทึก: 1. Eluting DNA with 50μl of Elution Buffer can increase DNA concentration but reduce the total yield; 2. The eluted DNA wash can be reapplied to the DNA extraction purification column for an additional collection at 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 minutes to increase DNA yield.)
รีวิว
ยังไม่มีบทวิจารณ์