Что такое ПЦР-SSCP? Приложения и полное руководство

С развитием методов молекулярной биологии, постоянно появлялись различные методы обнаружения генных структур и мутаций.. Особенно после появления ПЦР технология, различные методы обнаружения генов в сочетании с ПЦР еще больше способствовали развитию исследований генов.. Такие методы, как прямое секвенирование асимметричных продуктов ПЦР., рибонуклеазное расщепление (РНКаза), и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) стали мощными инструментами для анализа генов. Однако, эти методы относительно сложны в использовании, имеют существенные ограничения, или требуют высоких экспериментальных условий, что делает их непригодными для общеклинических лабораторий.

Представлен в 1989, ПЦР-SSCP (Одноцепочечный конформационный полиморфизм) постоянно совершенствуется и совершенствуется, сделать это проще, Быстрее, и более чувствительный метод обнаружения мутаций генов. Он используется не только для обнаружения точечных мутаций, делеций и вставок коротких последовательностей, но также применяется для количественного определения ДНК., мониторинг перекрестного загрязнения в диагностических экспериментах ПЦР, и расследование источников заражения. Благодаря выдающимся преимуществам SSCP, он широко применяется в последние годы.

Принципы и характеристики SSCP

• Открытие и основная концепция:
  • Одноцепочечная ДНК (оцДНК) фрагменты демонстрируют сложные пространственные складчатые конформации, поддерживаемые внутримолекулярными взаимодействиями., прежде всего спаривание оснований.
  • Единственное изменение основания может значительно или незначительно изменить пространственную конформацию., что приводит к различным моделям миграции в полиакриламидном геле..
• Механизм разделения:
  • Электрофорез в неденатурирующем полиакриламидном геле (СТРАНИЦА) может четко разделять молекулы оцДНК разной конформации из-за различных уровней препятствий в геле.
• SSCP-анализ:
  • Названный одноцепочечный конформационный полиморфизм (ССКП) японский исследователь Орита и его коллеги.
  • Применяется для обнаружения генных мутаций в продуктах, амплифицированных ПЦР., повышение простоты и чувствительности.
• Основной процесс:
  1. ПЦР-амплификация: Усилить целевую ДНК.
  2. Денатурация и ренатурация: Денатурируйте специфические продукты ПЦР и быстро ренатурируйте их с образованием одноцепочечных молекул ДНК со специфическими пространственными структурами..
  3. Неденатурирующая СТРАНИЦА: Выполните неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле на соответствующем количестве одноцепочечной ДНК..
  4. Обнаружение: Анализируйте результаты с помощью рентгенауторадиографии., серебряное окрашивание, или окрашивание бромистым этидием.
• Интерпретация:
  • Изменение скорости миграции оцДНК по сравнению с нормальным контролем свидетельствует об изменении конформации., предполагая базовую мутацию в этом фрагменте ДНК.
• Преимущества:
  • Простой, быстрый, и чувствительный метод.
  • Не требует специального оборудования.
  • Подходит для клинических лабораторий..
• Ограничения:
  • Обнаруживает только мутации; необходимо дальнейшее секвенирование, чтобы точно определить точное положение и тип мутации..
  • Требуются строгие условия электрофореза.
  • Возможны ложноотрицательные результаты, если точковые мутации существенно не изменяют конформацию оцДНК или если мешают другие условия..
• Эффективность обнаружения:
  • Несмотря на ограничения, SSCP может похвастаться высоким уровнем обнаружения по сравнению с другими методами..
  • Способен идентифицировать неизвестные базовые мутации внутри целевого фрагмента ДНК..
  • Такао продемонстрировал, что SSCP может обнаруживать 90% одноосновательных мутаций во фрагментах ДНК короче 300 б.п..
• Дальнейшие применения:
  • SSCP может отделять мутантную оцДНК с разной скоростью миграции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле..
  • Позволяет проводить дальнейшую очистку и идентификацию мутантных фрагментов ДНК на уровне последовательности..

Развитие и улучшение SSCP

• Начальная разработка:
  • Изначально, SSCP включал включение изотопов в продукты ПЦР-амплификации., и результаты были отображены с помощью авторадиографии. Это создало проблемы для широкого внедрения.
• Упрощение:
  • Сочетание окрашивания ДНК серебром с ПЦР-SSCP., особенно применение прямого окрашивания бромистым этидием, значительно упростил метод.
• Недавние примечательные улучшения:
  • Анализ РНК-SSCP:
    • Основной принцип: РНК имеет более сложные вторичные и третичные конформации., что делает его очень чувствительным к одноосновным мутациям, тем самым увеличивая уровень обнаружения.
    • Скорость обнаружения мутаций может превышать 90%.
    • РНК менее склонна к образованию двойных цепей., что позволяет использовать большее количество в электрофорезе, что полезно для окрашивания бромистым этидием.
    • Однако, этот метод добавляет этап обратной транскрипции и требует более длинных праймеров, содержащих последовательности промотора РНК-полимеразы., возрастающая сложность.
• Сочетание SSCP с другими методами обнаружения мутаций:
  • Гетеродуплексный анализ (Это):
    • Значительно повышает уровень обнаружения в сочетании с SSCP..
    • Включает гибридизацию зонда с целевой оцДНК или РНК.. Гибридные цепи, содержащие несовпадающую пару оснований, можно отделить от полностью комплементарных гибридных цепей посредством электрофореза в неденатурирующем геле PAG..
    • Выполнение как SSCP, так и Het-анализа одной и той же целевой последовательности может обеспечить почти 100% уровень обнаружения точковых мутаций, сохраняя при этом экспериментальную простоту.

Процедура ПЦР-SSCP

Приготовление геля на основе длины фрагмента ДНК

Для фрагментов ДНК короче 1Кб, Концентрацию полиакриламидного геля выбирайте следующим образом:

• Длина фрагмента ДНК (б.п.): % Концентрация акриламида
  • 1Кб–700б: 3.5%
  • 700б–500б: 5%
  • 500б–200б: 8%
  • 200б: 12%

Подготовка к SSCP

• ПЦР-амплификация: Усиливайте конкретный продукт с минимальным размытием (подтверждено электрофорезом в агарозном геле).

1. Приготовление полиакриламидного геля (ПАГ)

• Приготовьте раствор геля исходя из необходимой концентрации из таблицы выше..
• Вставьте расческу в форму для геля..
• Вылейте гелевый раствор с одного конца расчески., наклон формы к концу заливки, когда гель достигает зубцов расчески, чтобы предотвратить образование пузырьков.
• Дайте гелю затвердеть при комнатной температуре в течение 1 час.
• Снимите расческу и добавьте 1×TBE буфер поверх геля, чтобы покрыть его..

2. Электрофорез

1. Брать 10 мкл продукта ПЦР.
2. Добавлять 10 мкл денатурирующего агента (95% формамид, 10 ммоль/л ЭДТА, 0.02% бромфеноловый синий).
3. Добавлять 30 мкл минерального масла.
4. Варить в течение 5 минуты, затем немедленно поместите в ледяную баню минимум на 2 минуты.
5. Загрузите всю водную фазу в гель..
6. Провести электрофорез при 10-15°С.:
   • Начните с 300 В для 5 минуты.
   • Продолжайте с 120 В для 8 часы.
7. После электрофореза, окрасить гель в буфере 1×TBE, содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия для 30-45 минуты.
8. Наблюдайте под УФ-светом или переходите к окрашиванию серебром..

3. Серебряное окрашивание

1. Дважды промойте ПАГ деионизированной водой..
2. Фиксируют гель в растворе 10% этанол и 0.5% уксусная кислота для 6 минуты.
3. Дважды промыть деионизированной водой..
4. Погрузиться в 0.2% нитрат серебра (AgNO3) решение для 10 минуты.
5. Стирать 3-5 раз с деионизированной водой.
6. Разработать в решении 1.5% гидроксид натрия (NaOH) и 0.4% формальдегид для 7 минуты.
7. Остановить разработку с помощью 0.75% карбонат натрия (NaCO3).

Приложения SSCP

Поскольку Орита и его коллеги использовали SSCP для анализа полиморфизма ДНК человека., метод широко применяется в различных областях, включая выявление генных мутаций, связанных с раком и наследственными заболеваниями, а также при типировании вирусов и мониторинге заражения.

Обнаружение мутации гена рака

• Мутации, связанные с опухолью:
  • SSCP широко используется для обнаружения мутаций в генах, связанных с различными видами рака, такими как астроцитома., опухоли головного мозга, мелкоклеточный рак легких, рак желудка, и колоректальный рак.
  • Его применяли для обнаружения мутаций гена P53 в этих опухолях и мутаций гена ras при раке легких..
• Успешные приложения:
  • Недавно, Сугано и др.. успешно использовал окрашенный серебром SSCP для обнаружения мутации в положении 12 гена c-Ki-ras2, завершение процесса электрофореза и окрашивания в течение 2.5 часы.

Исследования наследственных заболеваний

• SSCP используется при изучении генов, участвующих в наследственных заболеваниях, таких как:
  • Муковисцидоз: Обнаружение мутаций в гене CFTR.
  • Тип нейрофиброматоза 1: Анализ генных мутаций.
  • Семейный аденоматозный полипоз: Генные исследования, связанные с этим заболеванием.
• РНК-SSCP против. ДНК-SSCP:
  • Шаркар и др.. использовали RNA-SSCP для обнаружения последовательностей генов в 28 больные гемофилией В.
  • Сравнение с DNA-SSCP и прямым секвенированием генов выявило 20 базовые мутации в гене фактора IX размером 2,6 т.п.н., с обнаружением РНК-SSCP 70% этих мутаций по сравнению с 35% обнаружен с помощью DNA-SSCP, демонстрируя более высокую чувствительность RNA-SSCP.

Типирование вирусов и мониторинг заражения

• Типирование вирусов:
  • SSCP используется для типирования вирусов и мониторинга заражения в экспериментах ПЦР..
  • ЯП использовал вложенную ПЦР для выявления образцов ВГВ из разных регионов, с последующим анализом SSCP, которые выявили отдельные шаблоны SSCP для каждого образца., указывая на региональные различия в ДНК HBV и исключая возможность перекрестного заражения..
• Мониторинг загрязнения:
  • SSCP служит надежным методом обеспечения точности результатов ПЦР-диагностики..

Исследования передачи патогенов

• SSCP используется для изучения путей передачи патогенов..

Количественный анализ ДНК

• Анализ клеток рака молочной железы:
  • ССКП, в сочетании с конкурентной ПЦР, использовался для количественного анализа мутантных генов P53 в клетках рака молочной железы..
  • Преимущество метода заключается в использовании внутренних стандартов, отличающихся от целевой ДНК всего одним основанием., обеспечение идентичных условий амплификации и, следовательно, более точное количественное определение ДНК.

Меры предосторожности для SSCP

SSCP – это быстрый, простой, и чувствительный метод обнаружения генных мутаций. Для достижения оптимальных результатов, следует соблюдать следующие меры предосторожности:

Повторяемость:

• Основными факторами, влияющими на повторяемость SSCP, являются напряжение электрофореза и температура.. Сохранение этих условий постоянными обеспечивает хорошую повторяемость шаблонов SSCP..
• В целом, Паттерны SSCP показывают две одноцепочечные полосы ДНК., но иногда может появиться только одна или более трех полос из-за схожих пространственных конформаций между двумя одноцепочечными молекулами ДНК.. Наличие более трех полос может указывать на смесь фрагментов ДНК дикого типа и мутантных..

Влияние длины последовательности целевой ДНК:

• SSCP более эффективен при обнаружении точечных мутаций в более коротких последовательностях ДНК или РНК, чем в более длинных.. Это может быть связано с тем, что одноосновные изменения в более длинных молекулах оказывают меньшее влияние на поддержание пространственной конформации..
• Некоторые исследователи полагают, что для цепей ДНК короче 400 б.п., длина не влияет на эффективность SSCP. Тщательный выбор условий эксперимента позволяет достичь уровня обнаружения, превышающего 90% для точковых мутаций в 354 фрагменты ДНК п.н..

Напряжение и температура электрофореза:

• Для поддержания стабильных пространственных конформаций одноцепочечной ДНК., SSCP следует проводить при более низких температурах. (обычно от 4°C до 15°C). Высокое напряжение в начале (250В) для 5 минут помогает первоначально разделить одноцепочечную ДНК различной конформации без значительного повышения температуры геля.. За этим должно последовать понижение напряжения. (около 100 В) для дальнейшего разделения прядей.
• Точное напряжение для электрофореза следует определять исходя из конкретных условий эксперимента..

Влияние положения точечной мутации:

• Положение точечной мутации в ДНК или РНК влияет на скорость обнаружения SSCP в зависимости от ее роли в поддержании пространственной конформации., а не его линейное положение в цепи.
• Мутации в центральной области ДНК обычно легче обнаружить по сравнению с мутациями на концах..
• Однако, даже мутации в центральной области могут остаться незамеченными, если они существенно не изменяют пространственную конформацию.. Например, Исследование Уайта показало, что только 2 из 9 обнаружены образцы с точечными мутациями в петле шпилечной структуры, что указывает на уровень обнаружения 22%.

Интерпретация результатов SSCP:

• SSCP разделяет одноцепочечную ДНК на основе пространственной конформации, а не молекулярной массы или заряда.. Иногда, скорости миграции нормальных и мутантных цепей очень близки, из-за чего их трудно различить.
• Обычно, длины электрофореза 16-18 см необходимы для точного определения результатов на основе предела обнаружения, что представляет собой наименьшую различимую разницу в расстоянии электрофореза между мутантными и нормальными фрагментами ДНК..
• Если расстояние превышает предел обнаружения (например, 3мм), указана мутация. Меньшее расстояние предполагает отсутствие изменений.. Установка низкого предела обнаружения может привести к ложным срабатываниям..
• Другие условия, например, количество загруженного ПЦР-продукта, степень сшивки ПАГ, и концентрация геля, следует выбирать на основе конкретных экспериментальных требований.

Подробности ПЦР-SSCP по шагам

Базовые приготовления

1. ПЦР-амплификация и обнаружение:
   • Выполните ПЦР-амплификацию с использованием соответствующих праймеров и выберите подходящую температуру отжига..
   • Обнаружьте продукты амплификации, запустив их на 2-2.5% агарозный гель методом горизонтального электрофореза. Нагрузка 3-5 мкл продукта ПЦР.
   • Оптимальная концентрация продукта ПЦР должна составлять около 10 нг/мкл.
2. Смешивание продукта ПЦР с денатурирующим буфером:
   • Добавлять 5 мкл буфера для образцов SSCP (денатурирующий буфер, то же, что и буфер секвенирования в «Молекулярное клонирование») на дно чистой пробирки для ПЦР.
   • Добавьте продукт амплификации ПЦР в центр буфера.. Отрегулируйте количество в зависимости от видимости полосы на агарозном геле.:
     • Если группа яркая, добавлять 1 мкл.
     • Если результат отличный, добавлять 0.5 мкл.
     • Если группа не очень ясна, добавлять 1.5, 2, или 3 мкл соответственно.
   • Пропорционально увеличьте объем буфера для образцов., например, для 3 мкл продукта ПЦР, добавлять 8 мкл буфера для лучшей денатурации.
3. Денатурация продукта ПЦР:
   • Центрифугируйте пробирку, чтобы сконцентрировать пробу внизу..
   • Денатурируйте образец при 95°C для 10 минут с помощью ПЦР-машина, затем немедленно поместите ПЦР-продукт на лед для 5 минут для предотвращения ренатурации.

   Примечание: Шаги 3 и 4 можно выполнить после четвертого этапа приготовления геля, ожидая его затвердевания..

Приготовление геля

1. Подготовка стеклянных пластин:
   • Промойте каждую пару стеклянных пластин водопроводной водой, а затем ddH2O..
   • Высушите стеклянные пластины впитывающей бумагой, а затем протрите безводным этанолом..
   • Дайте этанолу испариться в течение 2-3 минуты.
   • Соберите стеклянные пластины и поместите их в подставку для литья геля., обеспечение безопасности обеих сторон и дна.
   • Затяните монтажные винты, чтобы пластины оставались ровными.. (Проверьте наличие утечек, используя безводный этанол.)

Большие гели (50% Концентрация глицерина)

Маленькие гели (50% Концентрация глицерина)

Заливка геля

1. Смешивание геля: После приготовления раствора геля по предоставленной рецептуре, тщательно перемешать, чтобы обеспечить однородность.
2. Разливка в стеклянные тарелки: Аккуратно разлейте приготовленный раствор геля по собранным стеклянным пластинам.. Следите за тем, чтобы в процессе заливки не образовывались пузырьки воздуха.. Если наблюдаются пузырьки, осторожно наклоните тарелки, чтобы пузырьки поднялись на поверхность. Легкие постукивания по бокам пластин помогут выпустить пузырьки воздуха..
3. Установка расчески: Как только уровень раствора геля достигнет примерно 0,5 см ниже верхнего края стеклянной пластины., вставьте расческу в гель. Убедитесь, что между зубцами расчески и поверхностью геля нет пузырьков воздуха.. Если есть пузырьки, убрать расческу, выпустить пузыри, и осторожно вставьте расческу обратно.
4. Обеспечение полимеризации геля: После установки расчески, дайте гелю полимеризоваться, поместив пластины ровно или под небольшим углом. (меньше, чем 10 степени) на ровной поверхности примерно 30 минуты. В течение этого времени, гель полимеризуется и затвердевает.

Примечание: Это также подходящее время для того, чтобы приступить к денатурации образцов ПЦР, как описано в шагах. 3 и 4 первого раздела.

Загрузка геля

• Нанесение геля:
  • Снимите расческу с геля сразу после полимеризации..
  • Обеспечьте равномерное применение силы для поддержания целостности колодцев..
  • Закрепите гелевую пластину на аппарате для электрофореза лункой внутрь..
  • Медленно перемещайте гелевую пластину в буфер для электрофореза, чтобы избежать образования больших пузырьков воздуха..
• Предварительный электрофорез:
  • Добавляйте 1 × буфер для электрофореза TBE в верхний резервуар до тех пор, пока уровень жидкости не станет примерно на 1 см выше более короткого края стеклянной пластинки..
  • Убедитесь в отсутствии утечек из верхнего резервуара..
  • Установите напряжение 140–150 В для большого аппарата и 110–120 В для маленького аппарата..
  • Предварительный электрофорез в течение примерно 10 минуты.
• Загрузка образца:
  • Последовательно добавьте подготовленные образцы в лунки геля с помощью микрошприца..
  • Избегайте загрузки образцов в две лунки, ближайшие к краям каждой гелевой пластины..
• Электрофорез:
  • Установите напряжение 140–150 В для большого аппарата и 110–120 В для маленького аппарата..
  • Электрофорез проводят при температуре 10-15°С в течение минимум 10 часы.

Окрашивание

• Фиксация:
  • Удалить гель из аппарата, отметить отправную точку, и погрузить его в 70% этанол для 15 минуты на шейкере.
  • Соберите этанол после фиксации и дважды промойте дистиллированной водой в течение примерно 3 минут на полоскание.
• Окрашивание:
  • Окрашиваем гель в красящем растворе (200мл, содержащий 3.6% NaOH 4,2 мл, 20% AgNO3 3,6мл, нашатырный спирт 2мл) для 30 минуты.
  • Отрегулируйте время окрашивания, если окрашиваете два геля одновременно..
• Разработка:
  • Проявите гель в проявляющем растворе (200мл, содержащий 1% цитрат натрия 1мл, формальдегид 100 мкл) пока полосы не станут отчетливо видны.
  • Промыть три раза дистиллированной водой в течение 3 минут каждая, чтобы остановить развитие.
  • Альтернативно, окрасить гель, погрузив его в 1 × буфер TBE, содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия для 10 минут и визуализируйте в ультрафиолетовом свете.

Формулы

10×Формула ТВЭ:

• База Трис: 108г
• Борная кислота: 55г
• 0.5моль/л ЭДТА (рН 8.0), объем доведен до 1л.

Формула денатурирующего буфера:

• 98% Деионизированный формамид
• 10ммоль/л ЭДТА (рН 8.0)
• 0.025% Ксилолцианол FF
• 0.025% Бромфеноловый синий

Примечания:

1. Воспроизводимость:
   • Поддержание стабильного напряжения и температуры во время электрофореза является основным фактором, влияющим на воспроизводимость SSCP..
   • Обычно, Паттерны SSCP показывают две одноцепочечные полосы ДНК., но иногда может появиться только одна, три и более полос, возможно, из-за наличия сходных трехмерных конформаций между фрагментами ДНК дикого типа и мутантными..
2. Влияние длины последовательности целевой ДНК:
   • SSCP имеет более высокий уровень обнаружения точечных мутаций в короткоцепочечной ДНК или РНК по сравнению с длинноцепочечной ДНК.. Вероятно, это связано с тем, что изменения отдельных оснований в длинноцепочечных молекулах ДНК и РНК оказывают меньшее влияние на поддержание трехмерных конформаций..
   • В случае более коротких цепей ДНК (ниже 400 б.п.), длина ДНК не влияет на эффективность SSCP.
3. Влияние напряжения и температуры электрофореза:
   • Для поддержания стабильной трехмерной конформации одноцепочечной ДНК., SSCP следует проводить при более низкой температуре. (обычно от 4°C до 15°C).
   • Во время электрофореза, чрезмерное напряжение может вызвать повышение температуры. Поэтому, при проведении ССКП в емкости для электрофореза без охлаждающего устройства, более высокое напряжение (250В) следует использовать изначально, с последующим снижением напряжения примерно до 100 В для электрофореза..
4. Интерпретация результатов SSCP:
   • В анализе SSCP, разделение одноцепочечных фрагментов ДНК основано на размере их стерических препятствий, а не на молекулярной массе., таким образом, не может отражать молекулярную массу.
   • Интерпретация результатов должна основываться на пределе обнаружения., который относится к минимальной разнице электрофоретического расстояния между мутантными и нормальными фрагментами ДНК, которые можно различить..
5. Другие соображения:
   • Такие условия, как количество загруженного продукта ПЦР., плотность сшивки полиакриламидного геля, а концентрацию геля следует подбирать и определять исходя из конкретных условий эксперимента..